乳腺癌表达细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物p27^kip1的预后意义

中华肿瘤杂志 1999年第4期第21卷 基础研究

作者：吴炅　沈镇宙　邵志敏

　　关键词： 乳腺肿瘤；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂；预后

　　【摘要】　目的　研究p27^kip1在乳腺癌组织中的表达水平，及其与生物学行为的关系和对预后的作用。方法　以免疫组化法检测181例乳腺癌组织p27^kip1蛋白表达水平，其中91例进行了凋亡指数、凋亡相关蛋白bcl-2、bax的测定，另有106例检测了p21^WAF1/CIP1、p53、mdm₂蛋白表达水平。结果　本组181例中，p27^kip1蛋白阳性125例，占69.1%；低表达者121例，占66.9%；高表达者60例，占33.1%。乳腺癌组织p27^kip1蛋白水平与病理组织学分级、癌周浸润程度、肿块大小、腋淋巴结转移情况、TNM分期、术后局部复发与转移均相关，与bcl-2、bax、p53、p21^WAF1/CIP1、mdm₂蛋白表达水平亦相关。单因素生存分析结果，p27^kip1蛋白高表达组5年无病生存率93.7%优于低表达组64.7%(P=0.0001)。Cox模型多因素分析未显示p27^kip1蛋白表达水平是独立的预后指标。结论　细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(Cki)p27^kip1在乳腺癌中具有一定预后价值；p27^kip1不仅在细胞周期停滞中有作用，还有可能诱导DNA受损的细胞进入编程性细胞死亡。

Prognostic significance of cyclin-dependent kinase inhibitor p27^kip1 expression in human breast cancer　

WU Jiong, SHEN Zhenzhou, SHAO Zhimin. Department of Surgery, Molecular Biology Laboratory, Cancer Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032

　　【Abstract】　Objective　To study the expression of p27^kip1 in breast cancer in relation to biological behavior and prognosis.Methods　p27^kip1 expression at protein level was determined by immunohistochemistry technique in 181 patients with breast cancer. In addition, p27^WAF1/CIP1, p53 and mdm₂ were examined in 106 cases of this series. Data about apoptotic index, bcl-2 and bax protein expression were available in the other 91 patients.Results　Of the 181 patients, p27^kip1 expression was low in 121 (66.9%) and high in 60 (33.1%), respectively. p27^kip1 expression level was correlated with histological grade, tumor size, axillary lymph node status, post-operative recurrence, invasion and metastasis. It was also correlated with bcl-2, bax, p53, p21^WAF1/CIP1, and mdm₂ expression levels. Univariate analysis demonstrated better disease-free survival in patients with higher p27^kip1 expression than in those with lower expression. However, by Cox multivariate analysis, p27^kip1 expression level was not found to be of independent prognostic significance.Conclusion　As an inhibitor of cyclin-dependent kinase, p27^kip1 favors prognosis of human breast cancer not only by arresting cell cycle in G₁ phase but also inducing cancer cell apoptosis.

　　【Subject words】　Breast neoplasms　　Cyclin dependent kinase inhibitor　　Prognosis

　　处于增殖周期中的细胞受到精密的调控，周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依赖性激酶(cdks)是细胞周期的正向调节因子，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(Cki)是周期的负向调节因子。p27^kip1是cdk₂/cyclin E复合物的主要抑制剂，与肿瘤发生、发展的机制有关^［1］。p27^kip1被认为是一种新的肿瘤抑制基因，研究乳腺癌p27^kip1蛋白表达水平对于明确其预后作用，以及与乳腺癌生物学行为的关系有重要意义^［2］。

　材料与方法

　　一、 实验材料

　　1.病例： 181例乳腺癌病例中，91例进行了凋亡指数（AI）、凋亡相关基因bcl-2、bax蛋白表达的检测，106例进行了p21^waf1/cip1、mdm₂、p53蛋白表达的免疫组化测定。181例患者均在本院接受治疗和随访。中位年龄51岁(26～70岁)，中位随访时间5年(4～12年)，病理分型、腋淋巴结转移情况均为术后病理组织学检查结果，肿瘤直径为术前病史体检记录之肿瘤最大直径。随访：第1年每3个月1次，第2～3年每半年1次，以后每年1次。有完整的临床、病理及随访资料，本组病例临床及病理资料见表1。石蜡包埋的组织块制成5 μm厚的组织切片。

表1　181例患者的临床和实验室资料

　　2.免疫组化试剂： p27^kip1单抗(G173-524)购自美国Pharmingen公司，工作浓度1∶100。LSAB+试剂盒购自丹麦Dako公司(K0679，生物素化抗兔、抗鼠、抗羊免疫球蛋白-链霉亲和素-过氧化物酶)，DAB购自Dako公司。

　　二、实验方法

　　1.免疫组化染色：采用LSAB法。石蜡切片常规脱蜡、水化后，0.05%胰酶，37℃消化30分钟，高温抗原修复，切片置于0.01 mol/L柠檬酸缓冲液中(pH 6.0)，95℃加热10分钟，再保温10分钟，PBS洗后滴加一抗。滴加一抗50 μl，湿盒内4℃冰箱过夜，PBS洗；滴加Dako LSAB试剂盒中生物素化IgG，37℃ 20分钟，PBS洗；滴加链霉亲和素-辣根过氧化物酶50 μl，37℃30分钟，PBS洗；0.04%DAB+0.03% H₂O₂，室温下显色；清水洗后苏木素复染，常规脱水、透明、封片。

　　2.结果判断：阳性着色定位于细胞核，随机选择10个高倍视野，计数1 000个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分率。＜10%为(-)，10%～50%为(+)，＞50%为(++)。生存分析中，将(-)、(+)归为低表达组，(++)归为高表达组。阳性对照：选择癌旁正常小叶或导管上皮中阳性细胞。阴性对照：省略一抗为阴性对照。

　　3.统计方法： 采用上海市肿瘤研究所流行病室统计软件SPSS软件包，应用非参数统计中spearman等级相关对p27^kip1表达与临床及病理指标的相关性进行分析；应用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析，时序检验(logrank test)，根据寿命表各随访年份生存率作生存曲线；应用Cox比例风险模型进行生存的多因素分析。所有运算均在IBM-PC微机上进行。

结果

　　一、 p27^kip1蛋白在乳腺癌组织中的表达情况

　　p27^kip1蛋白产物在乳腺癌组织石蜡切片中，阳性着色定位于细胞核。本组181例中，阳性病例125例，占69.1%，其中强阳性60例，占33.1%。该蛋白在乳腺癌组织中表达呈异质性。

　　二、 乳腺癌组织p27^kip1蛋白表达水平与临床及病理指标的关系

　　本组病例p27^kip1蛋白表达水平与病理组织学分级、肿块大小、腋淋巴结转移、术后局部复发与转移均呈负相关，与ER表达水平无相关性(表2)。

　　三、乳腺癌p27^kip1蛋白表达水平与凋亡指数

表2　181例患者p27^kip1蛋白表达水平与

　　临床、病理指标的关系

　　^* P＜0.05　　^** P＜0.001(AI)、凋亡相关基因bcl-2基因族表达状况、细胞周期G₁期检查点相关基因表达水平的关系

　　本组病例p27^kip1蛋白表达水平与bax、p21^waf1/cip1蛋白表达水平呈正相关，与bcl-2、p53、mdm₂蛋白表达呈负相关，与凋亡指数接近正相关(P=0.075，表3)。

表3　181例患者p27^kip1蛋白表达水平与AI、凋亡相关

　　基因bcl-2基因族表达状况、细胞周期G₁期检

　　查点相关基因表达水平的关系

　　^* P＜0.05　　^** P＜0.001　　四、影响乳腺癌生存率的预后分析

　　1.单因素分析：对本组病例术后无病生存率进行分析，发现p27^kip1蛋白表达水平高的病例，5年无病生存率(93.7%)高于低表达的病例(64.7%)，差异有显著性(χ²=15.81，P=0.0001)。

　　2.多因素预后分析：本组病例术后影响预后的因素经Cox模型多因素分析，结果未能提示p27^kip1蛋白表达水平是一个独立的预后指标(B=0.7167,=0.8964,Wald=0.6392,P=0.4240)。

　　3.不同p27^kip1/AI、p27^kip1/p21、p27^kip1/p53表型的乳腺癌患者的生存情况：由表4可见，p27(L)/AI(L)、p27(L)/p21(L)、p27(L)/p53(H)表型的患者在各自的组别中预后最差。其复发和死亡人数分别占48.7％、44.8％和54.5％，差异有显著性（P＜0.05）。

表4　不同p27/AI、p27/p21、p27/p53表型的

　　乳腺癌患者的生存情况

　　注：(H)为高表达；(L)为低表达

讨论

　　p27^kip1是细胞周期G₁期负向调节因子，是cdk₂/cyclin E复合物的抑制剂，可使细胞周期停滞于G₁期^［3］。在静止期或分化中的细胞，p27^kip1蛋白表达高于增殖期细胞。实验证明p27^kip1与肿瘤发生有关，如p27^kip1缺失的小鼠易发生垂体肿瘤^［1］。

　　近来，对p27^kip1蛋白在肿瘤中的预后作用已相继见诸报道，例如在胃癌^［4］、非小细胞肺癌^［5］、前列腺癌^［6］、肠癌^［7］、乳腺癌^［8］中，p27^kip1蛋白高表达提示预后良好。我们运用免疫组化法对p27^kip1蛋白在181例乳腺癌组织中的表达情况做检测，发现p27^kip1阳性着色定位于细胞核，正常导管上皮、肌上皮、内皮细胞均有阳性着色，并可作为内对照，p27^kip1在本组乳腺癌组织表达阳性率69.1%，与文献报道一致。对本组181例乳腺癌进行预后分析，单因素分析提示，p27^kip1蛋白高表达的病例无病生存率优于低表达的病例；多因素分析虽未能提示p27^kip1蛋白表达是独立的预后因子，但我们认为p27^kip1蛋白在乳腺癌中的预后意义值得进一步研究。我们同时对不同p27^kip1/AI、p27^kip1/p21、p27^kip1/p53表型的乳腺癌患者的生存情况进行分析，发现p27(L)/AI(L)、p27(L)/p21(L)、p27(L)/p53(H)表型的患者在各自的组别中预后最差，说明联合检测G₁检测点相关基因及细胞凋亡水平，有助于判断乳腺癌预后。在G₁期检查点调节因子中，除p21^waf1/cip1蛋白表达之外，不能排除p27^kip1对乳腺癌亦有预后价值。本组研究结果表明，p27^kip1蛋白表达抑制与肿瘤高分级、肿瘤直径大、腋淋巴结转移、术后局部复发及远处转移均有相关性，说明p27^kip1蛋白低表达组病例，肿瘤恶性程度增高。

　　我们对p27^kip1蛋白表达与AI、bcl-2、bax，以及p27^kip1与p53、mdm₂、p21^waf1/cip1蛋白表达的相关性进行了研究。结果显示，p27^kip1与bax正相关，与AI接近正相关，与bcl-2负相关。说明p27^kip1产生G₁期停滞作用后，在细胞凋亡相关基因bcl-2、bax的相应改变下，细胞凋亡增加。由于p27^kip1主要抑制G₁后期细胞，即在进入S期前不久的细胞，说明这组变异、DNA受损细胞在经历G₁期停滞后，无法被修复，基本上以细胞凋亡的方式结束使命。在体外实验中，已有报道^［9］证实p27^kip1蛋白在乳腺癌细胞株中有诱导细胞凋亡的作用。另外，我们发现p27^kip1与p21^waf1/cip1蛋白表达正相关，提示两者可能均由同一个上游调节基因p53控制，两者共同参与了G₁期检测点的调控。