三苯氧胺对乳腺癌细胞凋亡和耐药性的影响

中华肿瘤杂志 2000年第1期第22卷 临床研究

作者：郑军　姚榛祥

单位：郑军（重庆医科大学临床学院普外科，400016）；姚榛祥（重庆医科大学临床学院普外科，400016）

　　关键词： 乳腺肿瘤；细胞凋亡；三苯氧胺；药物耐受性

　　【摘要】　目的　观察雌激素(E₂)及三苯氧胺(tamoxifen, TAM)对乳腺癌MCF-7细胞凋亡调控基因(bax、bcl-2)及多药耐药基因(mdr-1)的影响。方法　利用免疫组化法及原位杂交法检测MCF-7细胞在E₂和TAM作用后bax、bcl-2及mdr-1基因的变化。结果　E₂可以明显刺激bcl-2和mdr-1基因表达，而TAM则可使其降低。首次利用人工合成的bax寡聚脱氧核苷酸探针，对肿瘤细胞内bax mRNA进行原位杂交，显示bax mRNA可被E₂下调，但在TAM作用下明显升高。相关性分析显示，bcl-2和mdr-1基因之间在TAM作用后有相关性(r=0.6，P＜0.05)。结论　TAM在乳癌内分泌治疗中不仅可调节肿瘤细胞凋亡，也可降低肿瘤细胞耐药性，抗凋亡基因bcl-2和多药耐药性之间有密切的功能联系，对其深入研究将有助于肿瘤内分泌治疗的进展。

Effect of tamoxifen on apoptosis and drug resistance of breast cancer cells in vitro

ZHENG Jun, YAO Zhenxiang.

　　（ Department of General Surgery, Clinical College, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, China）

　　【Abstract】　Objective　To study the effect of estradiol (E₂) and tamoxifen (TAM) on the apoptosis regulatory genes (bax, bcl-2) and mdr-1 in MCF-7 cells.Methods　Immunohistochemistry, in situ hybridization were used to observe the changes in bax, bcl-2 and mdr-1 genes after treatment with E₂ and TAM.Results　E₂ had ability to increase the expression of bcl-2 and mdr-1 but TAM decrease the expression of both. Synthetic bax oligodeoxynucleotide (ODN) was used as probe to perform in situ hybridization. It was shown that bax mRNA in MCF-7 cells was down-regulated by E₂ and up-regulated by TAM. Significant correlation between bcl-2 and mdr-1 was observed after TAM treatment of MCF-7 cells (P＜0.05).Conclusion　TAM regulates cell apoptosis and inhibits development of drug-resistance of MCF-7 breast cancer.

　　【Subject words】　Breast neoplasms; Apoptosis; Tamoxifen; Drugs resistance

　　三苯氧胺(tamoxifen, TAM)是近年广泛用于临床的合成非类固醇抗雌激素药，现作为凋亡诱导剂，观察其对凋亡及耐药性的影响。

　　材料与方法

　　一、试剂和细胞培养

　　1.雌激素受体阳性MCF-7乳癌细胞株，由中科院上海细胞生物所提供。

　　2.无酚红RPMI 1640细胞培养液(Sigma公司)。

　　3.TAM及雌二醇(β-Estradiol)，分子量各为371.5及272.4(Sigma公司)，溶于70%乙醇，冰箱贮存备用。

　　4.细胞培养：参照Estti等^［1］方法，将MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清之培养液，37℃，5% CO₂孵育箱内贴壁生长3～4代后，取指数生长期细胞，每瓶1×10⁵个种于50 ml培养瓶，无血清RPMI 1640培养24 h作同步化处理，再加完全培养液(含10%的用活性炭吸附除去内源性雌激素之胎牛血清)培养24 h后分组实验。

　　5.培养细胞分组及处理：实验组1：E₂1×10^-8 mol/L处理；实验组2：TAM 5 μmol/L处理；实验组3：对照组(仅加等量乙醇)。1～3组均在0，24，48，72 h取细胞做检测。实验组4：E₂分别以0 mol/L，1×10^-10 mol/L，1×10^-9 mol/L，1×10^-8 mol/L处理72 h；实验组5：TAM分别以0 μmol/L，1 μmol/L，3 μmol/L，5 μmol/L处理72 h。

　　6.样本的制备：将盖玻片(22 mm×30 mm)裁为4小块，灭菌后放入24孔培养板内，将待检细胞分组传入各孔，待盖玻片上长满细胞后，取出玻片，PBS洗3 min×3次，电扇风干2 h，缓冲甲醛丙酮固定液固定后贮于4℃冰箱备用。

　　二、免疫组化法检测各组细胞内bax、bcl-2及mdr-1基因蛋白的表达

　　1.试剂来源：bax兔抗人多抗和bcl-2鼠抗人单抗(Santa Cruz公司)，工作浓度1∶40。mdr-1鼠抗人单抗(北京中山公司)，工作浓度1∶20。

　　2.免疫组织化学法：参照李培然等^［2］方法，各组高倍镜下随机观察200个细胞，计算阳性率，重复4次染色计算均值。以bcl-2高表达的HL-60细胞作为bcl-2阳性对照，以卵巢癌耐药细胞株SKOV₃作为mdr-1阳性对照，正常人淋巴细胞作为bax阳性对照，各实验组以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　三、原位杂交检测细胞内bax mRNA

　　1.探针设计：根据寡核苷酸探针设计原则^［3］，选择人类bax mRNA序列的外显子2中41～80位碱基作为结合序列，经计算机检索，与bax以外人类已知基因序列无同源性，序列如下：5′-AGCAAAAGG-GCCCCTGCTTTCATGATCTGCTCAGAGCTGG-3′。探针标记：3-末端标记(保灵曼地高辛kit)，浓度2.5 pmol/μl。

　　2.操作步骤：参照路建平^［4］方法，各组高倍镜下随机观察200个细胞并计算阳性率，重复3次染色计算均值。

　　四、统计方法

　　数据用均数±标准差(±s)表示，t检验和相关性分析(SAS软件)。

　　结果

　　1.E₂对bax、bcl-2及mdr-1蛋白表达的影响：E₂ 10^-8 mol/L作用不同时间后，bax蛋白表达逐渐减少，至72 h达最低(P＜0.05)。而bcl-2及mdr-1则表达逐渐增强，到72 h达最高峰，与对照组比较差异有显著性(P＜0.05)，两者相关性分析呈正相关(r=0.48，P=0.058，表1)。当E₂以不同浓度作用72 h后，bax蛋白随E₂浓度增高而降低，表现出有剂量依赖关系；相反，bcl-2及mdr-1表达增强。以上改变差异均有显著性(P＜0.05)，但两者相关系数r=0.4，P=0.14(表2)。

　　2.TAM对bax、bcl-2及mdr-1蛋白表达的影响：TAM 5 μmol/L作用不同时间后，bax仅在72 h略有下降，但bcl-2及mdr-1蛋白随着时间延长逐渐下降，以48 h及72 h最为明显(P＜0.05，表3)，两者下降与时间呈正相关(r=0.4，P=0.09)。当TAM以不同浓度作用72 h后，bcl-2及mdr-1随浓度增高明显降低，差异有显著性(P＜0.05)；而bax仅在TAM增至5 μmol/L时才略有减低。经相关性比较，bcl-2和mdr-1的下降与浓度呈正相关(r=0.6，P＜0.05，表4)。

表1　E₂ 10^-8 mol/L作用不同时间对bax、bcl-2及

　　mdr-1蛋白表达影响(阳性率%)

表2　不同浓度E₂对bax、bcl-2及mdr-1表达影响

　　(阳性率%)

　表3　TAM 5 μmol/L作用不同时间对bax、bcl-2及

　　mdr-1蛋白的影响(阳性率%)

表4　不同浓度TAM作用后bax、bcl-2及mdr-1

　　的变化(阳性率%)

　　3.原位杂交检测bax mRNA：与对照组(53.5±15.79)%比较，肿瘤细胞经E₂ 10^-8mol/L作用72 h后，细胞内bax mRNA明显减弱(23.17±8.25)%，而TAM 5 μmol/L作用后bax mRNA增强(90.17±3.15)%，以上差异均有显著性(P＜0.05)。

讨论

　　一、E₂及TAM对凋亡调控基因蛋白bax、bcl-2的影响

　　Teixeira等^［5］研究发现，在MCF-7细胞培养中除去E₂，将显著降低bcl-2 mRNA转录和bcl-2蛋白的表达，提高药物的敏感性，若再次加入E₂，则又可使bcl-2的转录和表达明显增高，但bax蛋白的表达受激素的影响较小。本研究提示，MCF-7细胞在加入雌二醇1×10^-8 mol/L后，bcl-2蛋白表达呈升高趋势，至72 h达最高峰，但bax蛋白在E₂作用下有降低，48 h、72 h差异均有显著性(表1)，且随着E₂浓度的增高，bax表达降低愈加明显(表2)，与Teixeira等^［5］人的观察不一致。为探索bax基因在核酸水平的变化，我们首次采用自行设计、标记的bax mRNA寡核苷酸探针，与经E₂作用72 h后的MCF-7细胞做原位杂交，结果显示，bax mRNA的转录在E₂刺激后的肿瘤细胞中明显低于对照组。TAM抗肿瘤的机理主要是通过和E₂竞争与受体蛋白的结合，抑制E₂的活性^［6］。由表3，4可见，肿瘤细胞在TAM作用后bcl-2降低，且随浓度增大，而降低愈加明显。bax的表达则是在开始24 h内略有增高，之后才开始下降。而bax mRNA原位杂交则显示在TAM作用后，bax mRNA明显增高。提示TAM抗肿瘤机理也与增强肿瘤细胞凋亡功能密切相关。

　　二、E₂及TAM对mdr-1的影响及其与bcl-2相关性探讨

　　关于bcl-2和mdr-1基因相关性报道甚少。Huang等^［7］对MCF-7细胞在E₂作用后检测bcl-2及mdr-1基因表达，发现仅bcl-2基因表达，在E₂ 10^-7 mol/L作用下增加了近4倍，而mdr-1基因无变化。Bosanquet等^［8］用荧光免疫法检测71例慢性淋巴细胞性白血病标本，则发现bcl-2和mdr-1基因表达蛋白有明显相关性(r=0.5，P＜0.001)。本研究提示，bcl-2与mdr-1蛋白在不同浓度TAM作用后，两者表达呈正相关性(r=0.63，P＜0.05)；而E₂各浓度处理组两者虽有一定的正相关性，但t检验差异无显著性(P＞0.05)。不能排除其结果存在抽样误差。关于bcl-2与mdr-1基因表达之间相关性的机理，Bosanquet等^［8］认为，bcl-2蛋白具有鸟嘌呤核苷酸调节蛋白(G-Protein)功能，当bcl-2过度表达时，可抑制磷脂酶A₂和花生四烯酸的作用，进而影响mdr-1蛋白与抗癌药物的结合。因此，在乳癌内分泌治疗中，TAM通过对凋亡调控基因的作用，不仅调节肿瘤细胞凋亡，而且也降低肿瘤细胞耐药性。对其深入研究将有助于肿瘤内分泌治疗的进展。

　　参考文献：

　　［1］　Estti AM, Huovinen RL, Laine AM, et al. Apoptosis in tamoxifen induced growth inhibition of human breast cancer cells in vitro. J Natl Cancer Inst, 1993, 85: 1412-1416.

　　［2］　李培然，范维珂.细胞培养及涂片的免疫细胞化学染色.重庆医科大学学报，1991，16：154-156.

　　［3］　卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993.156-157.

　　［4］　路建平主编.非放射性杂交技术.海口：南海出版公司，1996.67-77.

　　［5］　Teixeira C, Reed JC, pratt MAC. Estrogen promotes chemotherapeutic drug resistance by a mechanism involving bcl-2 proto-oncogene expression in human breast cancer cells. Cancer Res, 1995, 55: 3902-3907.

　　［6］　Jordan VC, Robert H. Molecular mechanims of antiestrogen action in breast cancer. Breast Cancer Res Treat, 1994, 31: 41-46.

　　［7］　Huang Yue, Ray S, Reed JC, et al. Estrogen increases intercellular p26 bcl-2 to p21 bax ratio and inhibits taxol-induced apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells. Breast Cancer Res Treat, 1997, 42: 73-81.

　　［8］　Bosanquet AG, Bell PB, Burlton A, et al. Correlation of bcl-2 with P-glycoprotein expression in chronic lymphocytic leukaemia and other haematological neoplasms but of neither marker with ex vivo chemosensitivity of patient survival. Leukemia Lymphoma, 1996, 24: 141-147.

收稿日期：1999-02-24