组织蛋白酶D表达与乳腺癌的关系

肿瘤 1999年第2期第19卷 论著

作者：袁建达　邵志敏　韩企夏　沈镇宙

单位：上海医科大学肿瘤医院外科分子生物学实验室(上海 200032)

关键词：乳腺肿瘤；组织蛋白酶D；侵袭；肿瘤转移；预后

　　目的　研究组织蛋白酶D(Cath-D)对乳腺癌侵袭、转移和预后的作用。　方法　采用免疫组织化学亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法，检测105例乳腺癌石蜡切片中肿瘤细胞(实质)和间质细胞组织蛋白酶D的表达，结合临床和病理资料分析其作用。　结果　组织蛋白酶D主要定位于细胞浆，部分增生的细胞可见定位于细胞核，间质细胞与实质细胞的Cath-D的定位基本相似。间质细胞以肿瘤周围的间质细胞组织蛋白酶D的表达量为高。Cath-D在乳腺癌实质和间质中总的表达率分别为49.5%(52/105)，56.2%(59/105)。实质Cath-D的表达与肿瘤细胞组织浸润、肿瘤大小、腋淋巴结转移、随访结果有关(P＜0.05)；与乳腺癌组织学分类、组织学分型、分级、年龄、ER、PR状态、局部复发、远处转移无关。间质Cath-D的表达与乳腺癌肿瘤大小、腋淋巴结转移、局部复发、远处转移、年龄、ER、PR状态、局部复发无关。实质与间质Cath-D的表达和乳腺癌患者的无瘤生存率有关(P＜0.05)；实质Cath-D表达与总生存率无关(P＞0.05)，而间质的Cath-D与总生存率有关(P＜0.05)。　结论　实质和间质乳腺癌组织蛋白酶D的表达都和侵袭、转移和预后有关。实质Cath-D反映肿瘤细胞的侵袭能力，而间质的Cath-D与远处转移和预后有关。间质Cath-D与实质Cath-D密切相关，相对而言，间质的Cath-D更能代表乳腺癌细胞的侵袭和转移的能力。组织蛋白酶D可作为一个与乳腺癌预后密切相关的预后指标。

　　CATHEPSIN D AND PROGNOSIS IN BREAST CANCER

Yuan Jianda,Shao Zhiming,Han Qixia,et al.Department of Surgery,Cancer Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200032

　　Objective：To study the effect of Cathepsin D(Cath-D) on breast cancer invasion, metastasis and prognosis.Methods：By means of ABC test, 105 breast cancer specimens in paraffin sections were examined for the expression of Cath-D.Results：Cath-D protein was detected in cancer cell cytoplasm;the expression rates in cancer cells and in stromal cells were 49.5% (52/105) and 56.2%(59/105) respectively.Expression of Cath-D in cancer cells was correlated to its invasiveness,bigger tumor size,higher axillary lymph node involvement and poorer prognosis(P＜0.05)，but not with those pathologic typing,grading,age,ER and PR status,local recurrence and distant metastasis.Expression of Cath-D in stromal cells was associated with bigger tumor size,axillary lymph node metastasis,regional recurrence,distant metastasis and poorer prognosis(P＜0.05).Conclusion：The neoplastic and stromal cathepsin D are neglected immunohistochemical prognostic parameters.They play a pivotal role in the invasion and breast cancer metastasis.It shows that cathepsin D,specially stromal catepsin D,induces breast cancer metastasis and influences the prognosis of patients.

　　Key words　Breast tumor　Cathepsin D　Invasion　Neoplasm metastasis　Prognosis

　　乳腺癌的远处转移是导致乳腺癌临床治疗失败的主要原因。乳腺癌的远处转移是一个复杂的多步骤的过程，涉及肿瘤细胞运动、基质膜降解、肿瘤细胞与宿主细胞的粘附、转移灶新生血管的形成等。组织蛋白酶D(Cath-D)作为一个基质膜降解酶在肿瘤的转移中起重要作用。晚近，许多研究表明Cath-D与肺癌、肠癌、肝癌的转移有关^［2～5］。本研究应用免疫组织化学方法检测肿瘤细胞(实质)与间质细胞中Cath-D的表达，探讨实质与间质的Cath-D在乳腺癌侵袭、转移中的作用，了解其临床意义。

　　材料和方法

　　一、材料

　　上海医科大学肿瘤医院1988～1989年手术切除的乳腺癌标本105例，术前未曾接受放疗和化疗。随访时间在2～9年，中位随访期5.1年，均为女性病例，年龄为25～78岁，平均年龄52.84岁。

　　每个病例均具有完整的临床病史资料，病理诊断和随访资料。参照《中国常见恶性肿瘤诊治规范第八分册乳腺癌》的标准，进行病理诊断，观察组织学分型、组织学分类、组织学分级和组织浸润等指标。组织学分级按Scarff-Bloom-Richardson法分为：1.组织分化程度(以腺管的形成为主要依据)，高分化为1分，中分化为2分，低分化为3分；2.核多形性：按轻、中、重分别定为1、2、3分；3.核分裂相：1～10个/10个高倍视野(HPF)为1分，11～20个/10个HPF为2分，＞21个/10个HPF为3分。将以上三方面得分相加，确定病理分级：1级(3～5分)为分化好，Ⅱ级(6～7分)为分化中，及Ⅲ级(8～9分)为分化差。病理分类：特殊型和非特殊型。组织浸润分：肿瘤边界清楚为Ⅰ级，癌瘤周边界部分清楚为Ⅱ级，癌瘤周边与周围组织分界不清楚，呈浸润性生长为Ⅲ级。无腋淋巴结转移为(-)组，1～3个腋淋巴结转移为(+)组，大于3个为()组。随访结果分：健在、带癌和死亡。所有死亡病例均死于乳腺癌。

　　二、方法

　　1、试剂

　　组织蛋白酶D CH18-0109多克隆抗体购于上海中达公司，ABC试剂盒Vector产品。

　　2、免疫组织化学染色

　　应用Hsu等^［1］免疫组化方法染色，石蜡切片制成5 μm，依次二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，0.05%胰酶消化，37 ℃ 20 min，0.03% H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，室温10 min，5% 小牛血清温育，室温20 min，加入一抗50 μl，4 ℃冰箱过夜，PBS洗3次，加入生物素化马抗鼠IgG 50 μl，4℃冰箱过夜，PBS洗3次，加入生物素化马抗鼠IgG 50 μl，37℃ 1 h，PBS洗3次，加入SABC试剂50 μl，37 ℃30 min，PBS洗3次，0.04% DAB-0.03% H₂O₂室温显微镜下控制显色5 min。由于组织蛋白酶D部分定位于细胞核，故未用苏木素复染，清水洗涤后常规脱水、透明，封片。

　　3、阳性染色反应分级判断标准

　　以细胞浆或细胞核出现棕色颗粒为阳性细胞。根据细胞浆阳性综色颗粒的着色深浅，将染色强度分为(Ⅰ)无反应或微弱反应；(Ⅱ)棕色反应；(Ⅲ)深棕色反应三组，计算(Ⅱ)、(Ⅲ)两组每例切片5个高倍视野中阳性染色反应细胞的百分率，并将(Ⅰ)组病例数归入染色反应(-)组，最后确定组织蛋白酶D染色反应半定量分级：(-)为0～25%，(+)为26～74%，(++)为75～100%。实验中去一抗作为阴性对照，同时应用MCF-7人乳腺癌细胞爬片染色作为阳性对照。

　　三、统计学分析

　　采用上海医科大学流行病学教研室Epi Info(5.0板本)统计软件进行χ²检验，比较组织蛋白酶D表达水平与乳腺癌临床及病理指标的关系。应用Kaplan Meier寿命表法计算总生存率和无瘤生存率。P＜0.05认为具有统计学意义。

　　结　　果

　　一、组织蛋白酶D的定位及表达水平

　　免疫组化染色的结果，105例乳腺癌实质与间质细胞组织蛋白酶D均定位于细胞浆、部分定位于细胞核，其染色强度和阳性细胞百分率明显不同，呈异质性分布。癌旁乳腺良性病变组织蛋白酶D的定位和乳腺癌细胞相似(见插页第3页图1)。

1 实质与间质Cath-D在乳腺癌细胞浆上阳性表达（SABC法×400）,

　　中央区为阳性肿瘤细胞,肿瘤周边间质细胞阳性表达

表1　实质和间质Cath-D蛋白表达水平与病理指标的关系

表2　实质和间质Cath-D蛋白的表达水平与临床指标的关系