IFN-α逆转白血病细胞耐药性的实验研究

　　第三军医大学学报1999年第21卷第3期

张勇　张翼军　夏顺中　周成康

　　提　要　目的：了解干扰素-α(IFN-α)逆转白血病细胞多药耐药性(MDR)的作用和可能机制。方法：采用链亲和素-胶体金原位杂交(SAG-ISH)检测了IFN-α孵育前后的52例白血病患者骨髓细胞的多药耐药基因(MDR₁)表达，用荧光分光光度法测定了IFN-α孵育前后的52例骨髓细胞内柔红霉素(DNR)浓度。结果：全部52例患者中24例(46.2%)MDR₁阳性，初治组与复发难治组相比相差显著。MDR₁阳性者骨髓细胞内柔红霉素浓度与阴性者相差显著。IFN-α孵育后的MDR₁阳性率与孵育前相差不显著，但经IFN-α孵育前后的MDR₁阳性者的骨髓细胞内DNR浓度相差显著，阴性者亦然。结论：IFN-α能增加白血病细胞内DNR浓度，其逆转MDR环节不在MDR₁基因水平上，而在其他耐药途径上。

　　关键词：白血病　干扰素类Ⅰ型　药物耐受性

　　目前治疗急性白血病(Acute leukemia,AL)的主要方法为化疗，而化疗成功的主要障碍之一是白血病细胞对化疗药物的多药耐药性(Multidrug resistance,MDR)。国内外不少学者用RT-PCR、Northern杂交、Slot杂交等方法检测白血病多药耐药基因(MDR₁)，并用不同的逆转剂研究其逆转MDR的效果和机制，但选择SAG-ISH检测MDR₁和IFN-α为逆转剂的报道不多。本实验采用光敏生物素(Ag)标记MDR₁ cDNA探针，以链亲和素(Ab)-胶体金为检测系统行白血病单个核细胞原位杂交，用荧光分光光度法测定其胞内柔红霉素(Daunorubicin,DNR)，体外研究了52例白血病患者MDR₁ mRNA的表达，用IFN-α作逆转剂对其逆转MDR的可能性和机制进行了实验探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1　病例

　　1995年5月至1997年2月我院住院治疗的急性白血病50例和慢性粒细胞白血病急变2例。其中急性髓细胞白血病(Actue myeloid leukemia,AML)30例，急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblast leukemia,ALL)20例，初治组(入院前未治者)17例，复发难治组(正规化疗2疗程不缓解，慢性急变，MDS转化的AL为难治者，复发者标准参照文献［1］)19例。男性33例，女性17例，年龄8～73岁，中位数42岁。全部病例采用国内的白血病诊断和疗效标准^［1］。

　　1.2　主要试剂

　　MDR₁ cDNA(157 bp)探针，光敏生物素及链亲和素-胶体金(均由军科院附属307医院提供)；IFN-α(8×10⁵U/支，深圳科兴生物制品有限公司提供)；DNR(20 mg/支，意大利爱宝大药厂生产)；10×PBA；1×PBS-DEPC液；洗Ⅰ液；洗Ⅱ液；显影液A；显影液B；对苯二酚；固定液；打孔液；封闭液；RPMI1640液；小牛血清(20%)；三氯乙酸(30%)；淋巴细胞分离液。

　　1.3　主要仪器

　　离心涂片机；CO₂孵箱；超声破碎仪；荧光分光光度仪。

　　1.4　原位杂交

　　参照文献［2］的方法。INF-α对MDR₁的逆转：①标本选择：抽取52例患者骨髓1 ml置于无菌肝素抗凝瓶中，淋巴细胞分离液密度梯度离心，制备单个核细胞，孵育24 h后，再用淋巴细胞分离液离心，将单个核细胞经1640漂洗离心2次，然后甩片置于-20℃密闭保存备用。②选择ISH-SAG所测MDR₁(+)的24例患者的标本，用前述相同方法再行原位杂交。

　　1.5　胞内DNR浓度测定^［3］

　　1.5.1　MDR阳性及阴性的细胞胞内DNR浓度测定　　将52例骨髓细胞制备成单个核细胞，加入等量RPMI1640稀释，37℃水浴振荡后加入DNR，使终浓度为2μg/ml，孵育150 min，冰浴或冷PBS 1 ml终止代谢，离心弃上清，细胞重复用冷PBS洗2遍，然后用PBS重新悬浮，细胞液置-30℃冰冻保存至测定。测前先溶化，然后用超声破碎仪(100 w，30 s)破碎细胞，上清在475/590 nm(狭缝各15 nm)条件下测荧光强度。

　　1.5.2　IFN-α作用后细胞胞内DNR浓度测定　　将52例骨髓细胞制备成单个核细胞，加入等量RPMI1640稀释，加入IFN-α 500 U/ml孵育24 h。方法同前再测定其荧光强度。

　　1.5.3　空白设置　　以不含DNR的相同成分为空白。

　　1.6　统计学处理

　　采用χ²检验(四格表确切概率法)和t检验。

　　2　结果

　　2.1　白血病MDR₁基因表达

　　2.1.1　白血病骨髓单个核细胞MDR₁基因表达　　52例白血病中有24例MDR₁(+)，24/52=46.2%，其中初治组8/17=47.1%，复发难治组15/19=78.9%，复发难治组与初治组相比相差显著(P＜0.05)。AML和ALL两组MDR₁阳性检出率差异无显著性(P＞0.05)。

　　2.1.2　IFN-α作用后白血病骨髓单个核细胞MDR₁基因表达　　IFN-α500 U/ml与白血病患者骨髓单个核细胞孵育24 h后，MDR₁阳性24例中有19例仍为阳性，5例转阴，阴转率5/24=20.8%,孵育后MDR₁阳性率下降为19/52=36.5%，与孵育前相比差异无显著性(P＞0.05)。初治组和复发难治组孵育前后分别比较差异也不显著(P＞0.05)，IFN-α孵育前后SAG-ISH检测白血病MDR₁表达，见表1。

表1　IFN-α孵育前后用SAG-ISH检测的白血病MDR₁基因的表达

　　tab1　The expression of MDR₁ of leukemia by SAG-ISH before and after iFN-α incubation

　　2.2　白血病骨髓细胞胞内DNR浓度测定

　　2.2.1　原理　　柔红霉素具有发天然荧光的特点；体外培养条件下不引起DNR的转化及代谢物产生。

　　2.2.2　标准曲线　　制备含DNR 0.1～400.0 ng/ml系列浓度梯度，加入RPMI1640和30%三氯乙酸后测荧光强度，以不含DNR的相同溶液为空白，发现从10.0～400.0 ng/ml显示良好线性。

回归方程：y=2.1705+0.0540χr=0.9980，P＜0.01,检测低限为2.0 ng/ml

　　2.3　MDR阴性与阳性的骨髓单个核细胞胞内DNR浓度，见表2

表2　MDR₁阴性与阳性的骨髓单个核细胞胞内DNR浓度(ρ_B/ng·ml^－1)

　　tab2　DNR concentration of MDR₁ in positive and negativebone marrow mononuclear cell(ρ_B/ng·ml^－1)

　　3　讨论　　多药耐药性指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他结构不同，作用靶位不同的抗肿瘤药物亦具有抗药性。1970年Biedler和Riehm首次描述了肿瘤细胞多药耐药性(MDR)^［4］，现已证明MDR家族是由MDR₁和MDR₃组成，但仅MDR₁及其基因产物起着多药耐药性的作用，而P-glycoprotein(Pgp或P-170)是MDR₁基因的编码产物。它从分解ATP获得能量，将细胞药物“泵”出体外，使其胞内药物浓度下降，从而使细胞在低药物环境中存活，即产生MDR。近年来的研究表明，MDR除与MDR₁基因过度表达有关外，多药耐药相关蛋白的异常表达，拓扑异构酶Ⅱ活性下降，谷胱甘肽s-转移酶活性增高等多种因素均可能参与MDR的产生。国内外多应用检测MDR₁来研究MDR及其逆转，检测MDR₁的主要方法包括免疫组化、Northern印迹杂交、Slot印迹杂交，用非同位素SAG-IST检测MDR₁目前仅见于国内杜跃斌等人^［2］。关于逆转到抑制MDR的机制，国内外学者进行了不少研究。

　　Beksac等^［5］用单抗C129，通过免疫过氧化酶法证明异搏定(Verapamil,VRP)和环孢菌素A(Cyclosporine a, CSA)能降低Pgp阳性率，Paietta等^［6］以VRP及CSA为逆转剂，用流式细胞仪检测Rh-123溢出与Pgp单抗4E-16显示相同，但用定量PCR检测MDR₁则不被抑制，表明抑制机制可能在Pgp活性上。Solary^［7］和Dhainau等均分别认为三氮杂苯和VRP一样，主要是通过抑制Pgp而具有MDR的调制作用的。Bennis等^［8］则证实VRP能增加azidopine与Pgp结合，从而使化疗药物在细胞内蓄积而起逆转作用的。Wigfer等^［9］认为amiodarone、CSA、DMDP、奎尼丁是MDR泵——Pgp的抑制剂，而奎尼丁的环氧代谢物则是有效的泵抑制剂^［10］。Sato等^［11］证实金鸡纳衍生物——MS209与VRP一样，并通过与PgD的相互作用而逆转MDR的。Gollapudi等^［12］用HL60/AR及HL60细胞分别作阴阳性对照，用Cationic染色法证明CSA作用于Pgp，引起耐药细胞膜的去极化而产生逆转效能。

　　我们的实验结果表明，MDR₁阳性与MDR₁阴性的细胞内DNR浓度相差显著(P＜0.05)，支持MDR₁是通过降低细胞内DNR浓度而最终起作用的观点，这已经得到大家的公认^［5～12］。MDR₁阳性的细胞在IFN-α作用后，其阳性率与作用前相比相差不显著(P＞0.05)，说明IFN-α并不能逆转MDR₁ mRNA本身，但IFN-α作用前后的MDR₁阳性的细胞内DNR浓度相差显著(P＜0.05)，证明IFN-α又具有增加耐药白血病细胞内DNR浓度的作用，其作用的环节可能是MDR₁以外的其它途径，有待进一步研究。IFN-α作用后的MDR₁阴性细胞内DNR浓度也较前明显增加，证明IFN-α具有增加MDR₁阴性白血病细胞内DNR浓度的作用，从而增加白血病细胞对化疗的敏感性，因此用IFN-α逆转白血病MDR的机制，有进一步研究的价值及临床应用前景。

　　作者简介：张勇，男，31岁，主治医师，讲师，硕士作者单位：第三军医大学附属西南医院血液科　重庆，400038

　　参考文献

　　1　张之南.血液病诊断及疗效标准.天津：天津科学技术出版社，1991.152，163，190，195

　　2　杜跃斌，艾辉胜，王桂林，等.链亲和素-胶体金原位杂交检测白血病多药耐药基因表达.实验血液杂志，1996，4(3)：299

　　3　马建国，杨纯正，李　中，等.白血病内柔红霉素的测定.药物分析杂志，1992，12(1)：9

　　4　Kaye S B. The multidrug resistance phenotype. Br J Cancer,1988,58(6):691

　　5　Beksac M, Akan H, Koc H, et al. P-glycoprotein expression in refractory hematological neoplasms and circumvention of resisitance with verapamil or cyclosporine： A containing protocols. Med Oncol Tumor pharmacother,1992,9(2):101

　　6　Paietta E, Andersen J, Racevskis J, et al. Modulation of multidrug resistance in de novo adult acute myeloid leukemia: Veriable efficacy of reverting agents in vitro. Blood Rev,1995,9(1):47

　　7　Solary E, Velay I, Chanffert B, et al. Sufficient levels of quinine is the serum circumvent the multidrug resistance of the human leukemic cell line k502/ADM. J Med Chem,1992,35(13):2481

　　8　Bennis S, Ichas F, Robert J. Differential effects of verapamil and quinine on the reversal of doxorubicin resistance in a human leukemia cell line. Int J cancer,1995,62(3):283

　　9　Wigfer P W, Patterson F K. Reversal agent inhibition of the multidrug resistance pump in human leukemic lymphoblasts. Biochim Biophys acta,1994,1189(1):1

　　10　Wigfer P W. Lyon K L, Patterson F K, et al. Epoxide metabolite of quinine and inhibition of the multidrug resistance pump in human leukemic lymphoblasts. Mol Pharmacol,1994,46(3):562

　　11　Sato W, Fukazawa N, Nakanishi O, et al. Reversal of multidrug resistance by a novel quinoline derivative MS-209. Cancer Chemother pharmacol,1995,34(4):271

　　12　Gollapudi S, Gupta S. Lake of reversal of daunorubicin resistace in HL60/AR cell by cyclosporin A. Anticancer Res,1992,12(13):2127