人重组TFAR19蛋白对白血病细胞株HL-60的促凋亡效应①

中国免疫学杂志 2000年第1期第16卷 分子与细胞免疫学

作者：张颖妹　徐秀珍　刘红涛　宋泉声　马大龙

单位：张颖妹（北京医科大学卫生部医学免疫学重点实验室　北京　100083）； 徐秀珍（北京医科大学卫生部医学免疫学重点实验室　北京　100083）； 刘红涛（北京医科大学卫生部医学免疫学重点实验室　北京　100083）； 宋泉声（北京医科大学卫生部医学免疫学重点实验室　北京　100083）； 马大龙（北京医科大学卫生部医学免疫学重点实验室　北京　100083）

关键词：TFAR19；凋亡；HL-60细胞；Caspase-3

　　摘　要：目的：对一种新发现的凋亡相关基因TFAR19进行蛋白质水平的促凋亡效应研究，并对其作用机理进行初步的探讨。方法：利用离子交换层析对大肠杆菌表达的人重组TFAR19蛋白进行纯化，将其加入到培养的白血病细胞株HL-60，通过DNA片段化、PI及Annexin V标记进行流式细胞仪分析，观察TFAR19蛋白的促凋亡效应。利用FITC标记TFAR19蛋白，分析其与细胞的结合及定位。利用Caspase-3抑制剂DEVD-fmk研究TFAR19的凋亡信号转导途径。结果：高纯度的重组TFAR19蛋白剂量依赖性地促进撤除血清的HL-60细胞的凋亡，最高可使82%细胞凋亡，对照为30%。荧光标记的TFAR19蛋白能与HL-60细胞结合，主要定位于细胞核。DEVE-fmk可部分抑制TFAR19蛋白的促凋亡效应。结论：TFAR19蛋白能够直接进入HL-60细胞，发挥其促进细胞凋亡的效应。这一效应部分地与Caspase-3的凋亡执行效应有关。

　　分类号：R371

The apoptosis-accelerating effect of human recombinant TFAR19 protein on leukemia HL-60 cells

ZHANG Ying-Mei

　　Laboratory of Medical Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083

　　XU Xiu-Zhen

　　Laboratory of Medical Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083

　　LIU Hong-Tao

　　Laboratory of Medical Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083

　　Abstract：Objective: To study the apoptosis-accelerating effect of a novel human protein named TFAR19 (TF-1 cells apoptosis related protein 19) whose encoding cDNA has been cloned in the laboratory, and try to find out the mechanism of its effect. Methods： By using ion exchange chromatography, the human recombinant TFAR19 protein was isolated. The purified protein was co-cultured with HL-60 cells and the apoptotic cells were analyzed by DNA fragmentation, PI and Annexin V-labeled FACS assay. The FITC labeled TFAR19 protein w used as probe to observe its localization within the HL-60 cells. For the signal transduction study, a caspase-3 inhibitor DEVD-fmk was used to block the TFAR19 effect. Results： The TFAR19 protein dose-dependently increases the apoptotic HL-60 cells which have been previously withdrawn serum from culture, up to 82% cells are apoptotic cells comparing with control 30% cells. FITC labeled TFAR19 protein binds with HL-60 cells and mainly localized within the nucleus. DEVD-fmk partly inhibits apoptosis-accelerating effect of the TFAR19 protein. Conclusion: TFAR19 protein can directly enter HL-60 cells and exhibits an apoptosis-accelerating effect. Caspase-3 as an apoptosis effector may involve the effect of TFAR19.

　　Key words：TFAR19　Apoptosis　HL-60 cells　Caspase-3▲

　　凋亡（Apoptosis）或程序化死亡是基因控制的细胞自我毁灭的过程，它在机体的发育和内稳定的维持中起着至关重要的作用^［1，2］。由于细胞凋亡为多阶段，多系统，多基因参与的复杂过程，目前对其参与的全部基因尚未了解清楚。本研究组在对红白血病细胞株TF-1细胞的凋亡相关基因研究中，曾经成功地克隆了一个新的凋亡相关基因的全长cDNA（GenBank登记号为AF014955），将其构建的真核表达载体转染TF-1等细胞后，可加速这些细胞的凋亡，证明其为凋亡相关基因并命名为TFAR19（TF-1cell apoptosis related gene），同时还证明其定位于细胞核^［3，4］。为进一步研究在蛋白质水平上TFAR19的作用，本工作重点探讨了重组TFAR19蛋白对白血病细胞的影响，并对其作用机理进行了初步探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　试剂　ApoAlert^TM Apoptosis Kit, Caspase-3抑制剂DEVD-fmk购自Clontech公司。具有诱导凋亡效应的蛋白激酶抑制剂Staurosporin购自Sigma公司。

　　1.1.2　菌种与细胞株　质粒：pMTY4-TFAR19，本室构建^［3，4］，含PL启动子，可在大肠杆菌表达MS2-凝血酶接头-TFAR19融合蛋白，分子量约为25 kD，经凝血酶切割后可收获非融合的重组TFAR19蛋白，分子量约为14 kD。宿主菌：大肠杆菌pop2136（CI857温度敏感）为C600衍生菌，编码温度敏感λ阻遏蛋白，由Raiband博士惠赠。细胞株：HL-60细胞株为人早幼粒细胞系，本室保存。

　　1.2　方法

　　1.2.1　重组TFAR19蛋白在原核细胞中表达和纯化　pMTY4-TFAR19可在pop2136菌株中以包涵体的形式经42℃诱导表达融合蛋白，收集细菌经超声裂解洗涤，制备成包涵体，在8 mol/L尿素，20 mmol/L Glysine-NaOH（pH10.0）中，37℃变性30 min，将变性液稀释至1 mol/L尿素复性，以HAc/NaAc(pH4.5)调复性液pH为8.5，凝血酶27℃孵育过夜，利用DEAE离子交换层析进行蛋白质纯化，20 mmol/L Glysine-NaOH/HAc NaAc(pH8.5)条件下上样，50 mmol/L Tris-HCl(pH8.9) NaCl梯度洗脱，在0.06 mol/L NaCl盐浓度洗脱下目的蛋白，SDS-PAGE分析重组蛋白的表达和纯度。

　　1.2.2　重组TFAR19蛋白对HL-60细胞凋亡的影响　HL-60细胞在含10%小牛血清RPMI 1640培养液中培养2 d后，离心收集细胞，用无血清1640洗涤细胞2次，以无血清1640调整细胞浓度为1.2×10⁶ ml^-1，放入24孔培养板中，实验孔分别加入纯化的TFAR19蛋白25、20、15、10、5 μg，对照孔加入与其实验孔等体积的PBS，放入37℃培养箱5%CO₂，16 h后收获，对凋亡细胞进行检测。

　　1.2.3　细胞凋亡后DNA片段化的检测　收集TFAR19蛋白作用后的HL-60细胞，加入裂解液及蛋白酶K，50℃，1 h，再加入RNAse 50℃，1 h，加入TE缓冲液，70℃条件下加入低熔点的1%Agarose，通过1.3%Agarose DNA电泳，观察凋亡细胞梯形条带的形成。

　　1.2.4　凋亡细胞DNA含量的流式细胞仪分析　TFAR19蛋白处理过的HL-60细胞经PBS洗涤2次，溶于PBS中加入RNAse(10 mg/ml)5 μl，37℃作用30 min，加入（10 mg/ml）碘化丙啶（PI，Propidium iodide）10 μl。用流式细胞仪测定细胞DNA结合PI的荧光强度，在DNA的荧光直方图中，分析前向角散射光强度（FCS）和侧向散射光强度（SSC），以确定凋亡细胞的百分数，并可同时进行细胞周期的分析。

　　1.2.5　ApoAlert^TM试剂盒检测凋亡细胞　收集重组TFAR19蛋白处理后的HL-60细胞PBS洗3次后，用200 μl 1×Binding Buffer悬起，加入5 μl Annexin V-FITC，5 μl PI，室温避光放置15～20 min，加入400 μl PBS，利用流式细胞仪488 nm波长分析细胞凋亡数量和凋亡程度。除设定PBS组对照外，还设定一组凋亡诱导剂Stuaurosporin作为阳性对照。

　　1.2.6　Caspase-3抑制剂DEVD-fmk阻断效应检测　HL-60细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基培养48 h，以Hank's液洗涤后铺入96孔细胞培养板，分为4组，一组加入PBS，一组加入TFAR19蛋白，两组加入DEVD-fmk（终浓度30 μm）。每组3个复孔，5%CO₂ 37℃培养1 h后离心弃去DEVD-fmk，分别换成PBS及TFAR19蛋白，并一律用无血清RPMI 1640培养基5%CO₂ 37℃培养16 h。各孔取等量细胞加入伊红Y，光学显微镜下记录死细胞数目。

　　1.2.7　FITC标记TFAR19蛋白和细胞定位研究　FITC以一滴DMSO溶解后加入0.5 ml碳酸盐Buffer（pH9.5）加入纯化后的TFAR19蛋白混匀，装入透析袋，用碳酸盐Buffer磁力搅拌，4℃透析，取出后，过Sephadex G25柱，以碳酸盐Buffer平衡，上样后以0.01 mol/L PBS(pH7.6)洗脱，收集结合FITC的大分子TFAR19蛋白。将洗涤后的HL-60细胞溶于100　μl PBS中，加入100　μl TFAR19-FITC，4℃作用30 min，冷PBS洗后，滴片，荧光显微镜下观察。

　　2　结果

　　2.1　重组TFAR19蛋白的纯化　重组TFAR19蛋白经包涵体洗涤、变性、复性、阴离子交换层析后，可获得95%以上纯度的蛋白，图1可见两批纯化蛋白的结果。

图1　人重组TFAR19蛋白的大肠杆菌表达和纯化

　　Fig.1　The purification of rhTFAR19 expressed in E.coli

　　Note:a.Bacterial sample before induction;b.Bacterial sample after induction;c.The IBS;d.Protein marker;e.f.The purified rhTRAF19

　　2.2　重组TFAR19蛋白对HL-60细胞的促进DNA片段化的效应　通过DNA片段化的分析，证明重组TFAR19蛋白对撤除血清诱导凋亡的HL-60细胞有明显的促凋亡效应，见图2。

图2　TFAR19促进HL-60细胞DNA片段化的电泳结果

　　Fig.2　The fragmentaion of HL-60 cells enhanced by rhTFAR19

　　Note:a.the genomic DNA of HL-60 cell cultured in 10% FBS 1640;b.λ DNA HindIII marker;c.the genomic DNA of HL-60 cell cultured in 1640 medium without FBS;d.the genomic DNA of HL-60 cell cultured in 1640 medium with rhTFAR19 without FBS;e.the genomic DNA of HL-60 cell cultured in 1640 medium with staurosporin without FBS

　　2.3　重组TFAR19蛋白作用于HL-60细胞的PI染色流式细胞仪分析　用流式细胞仪测定TFAR19蛋白作用后的HL-60细胞DNA结合PI的荧光强度，在DNA的荧光直方图中，凋亡细胞表现为G1/G0峰前的低宽的亚二倍体峰，且此峰的高低与TFAR19蛋白的浓度在一定剂量范围内呈正相关，表1系根据此峰可得到凋亡细胞的百分比。对DNA直方图提供的参数进一步分析证明，TFAR19蛋白作用后的HL-60细胞S期减少，G2M期增加（图略）。

表1　TFAR19作用于HL-60细胞流式细胞仪分析结果

　　Tab.1　The effect of TFAR19 on HL-60 cell using FACS analysis

　　2.4　重组TFAR19蛋白作用于HL-60细胞的Annexin-V分析　重组TFAR19蛋白作用的HL-60细胞经Annexin-V-FITC标记后，显示出荧光强度增加（图3），与PBS对照组比较，TFAR19组凋亡细胞出现较早，故细胞膜破损较严重，FITC及PI双染比例增加。高浓度组效果更为明显。作为阳性对照的凋亡诱导剂Staurosporin出现与TFAR19类似的变化。

图3　TFAR19作用HL-60细胞的Annexin V kit流式细胞仪检测结果

　　Fig.3　The effect of TFAR19 on HL-60 cell labeled with Annexin-V using FACS analyisis

　　Note:A.the effect of PBS buffer on HL-60 cell for 16 h in 1640 medium without FBS;B.the effect of rhTFAR19(20 μg/ml)on HL-60 cell for 16 h in 1640 medium without FBS;C.the effect of rhTFAR-19(10 μg/ml)on HL-60 cell for 16 h in 1640 medium without FBS;D.the effect of staurosporine(10 μg/ml)on HL-60 cell for 16 h in 1640 medium without FBS

　　2.5　Caspase-3抑制剂对TFAR19蛋白效应的阻断作用　利用染料排斥法检测Caspase-3抑制剂DEVD-fmk的细胞死亡阻断效应，发现其可阻断撤除血清诱导的HL-60细胞死亡，同时对TFAR19蛋白的促进细胞死亡的作用亦有明显阻断作用（表2）。

表2　DEVD对TFAR19促进HL-60细胞死亡的阻断作用

　　Tab.2　The blocking effect of DEVD on HL-60 cell death enhanced by TFAR19

　　2.6　FITC标记TFAR19蛋白的细胞定位研究　荧光显微镜观察发现，FITC标记的重组TFAR19蛋白能够进入HL-60细胞，主要分布于细胞核、细胞浆和细胞膜，有少量荧光标记出现（图略）。

　　3　讨论

　　本研究小组在利用cDNA-RDA技术（cDNA-Representative differences analysis）研究TF-1细胞株去细胞因子所致凋亡高表达基因的过程中，克隆了一个新的全长cDNA序列，将之命名为TFAR19。TFAR19全长559碱基，包括polyA 和“AATAA”加尾信号。25～399碱基编码125个氨基酸的蛋白质。斑点杂交和Northern杂交证实此基因在TF-1细胞的凋亡过程中表达明显增高。计算机分析和绿色荧光蛋白标记实验发现其主要定位于细胞核。真核细胞表达TFAR19的质粒转染一些白血病细胞后可促进这些细胞的凋亡，包括撤除细胞因子的TF-1细胞、撤除血清的Hela细胞和MG803细胞^［3，4］。同时，本研究小组还利用生物信息学对EST（Expressed sequence tag）数据库进行检索和拼接，成功地克隆了小鼠TFAR19的编码区cDNA^［5］。在这些工作的基础上，本文进一步发现，大肠杆菌表达的人重组TFAR19蛋白能够进入体外培养的HL-60细胞，并主要定位于细胞核，促进撤除血清的HL-60的细胞凋亡，减少S期细胞，增加G2/M期细胞，其效应能够部分被Caspase-3的抑制剂所阻断。这一工作的意义在于首次在蛋白质水平上发现了TFAR19的促进凋亡效应和初步的信号转导机理。同时，由于发现了人重组TFAR19蛋白能够直接进入细胞，这为今后的TFAR19应用研究打下了基础，将有可能直接利用重组TFAR19蛋白在动物体内研究其功能及可能的肿瘤治疗应用。

　　在细胞凋亡信号转导过程中，可分为Caspase依赖性和Caspase非依赖性的途径^［6］，前者途径中最重要的凋亡执行者是Caspase-3，而DEVD-fmk多肽分子是其特异性的、不可逆的抑制剂。本文在研究中发现，撤除血清的HL-60细胞死亡可被DEVD-fmk有效抑制，TFAR19的促凋亡效应亦能被明显抑制，说明TFAR19的效应至少部分依赖于Caspase-3通道。至于TFAR19效应是否涉及Caspase非依赖性的途径如JNK途径尚待进一步的分析。

　　本实验虽然明确了TFAR19蛋白对HL-60细胞促凋亡的效应，但尚有更多的问题有待于解决，包括TFAR19作用的分子机理、生理功能、细胞作用谱等。

　　致谢：感谢北医大陶家平教授，马士良老师和韩梅老师帮助进行流式细胞仪检测和数据分析。感谢范中玉、黄家强、陈英玉、顾维丰、钟英城等同志在论文的完成及打印工作中给予的帮助。■

　　①本课题为国家自然科学基金资助课题（39870427）

　　作者简介：张颖妹，女，43岁，主管技师，主要从事免疫学研究；

　　马大龙，男，47岁，教授，博士生导师，主要从事分子免疫学研究

　　参考文献 ：

　　［1］Thompson E B. Special topic: apoptosis. Annu Rev Physiol, 1998； 60:525

　　［2］Ashkenazi A ， Dixit V M. Death receptors: signaling and modulation. Science, 1998； 281:1305

　　［3］刘红涛，王玉刚，张颖妹 et al. 凋亡相关新基因TFAR19的cDNA克隆、表达和功能研究.高技术通讯，1998；8（5）：6

　　［4］Liu H T, Wang Y G, Zhang Y M et al. TRAR19, a novel apoptosis-related gene cloned from human leukemia cell line TF-1, could enhance apoptosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal. Biochem Biophy Res Commun, 1999；254：203

　　［5］宋泉声，韩文玲，刘红涛 et al.小鼠凋亡相关新基因TFAR19 cDNA的克隆化和序列分析.北京医科大学学报，1999；31(4)：309

　　［6］Vincent J K. Proteolytic activities that mediate apoptosis. Annu Rev Physiol, 1998;60:573

收稿日期：1999-07-26