病毒性L6565白血病细胞克隆株的建立及其特性研究进展

中国病理生理杂志 2000年第7期第16卷 综　述

作者：程立　殷莲华　赵新永

单位：(上海医科大学病理生理学教研室， 上海 200032）

关键词：白血病；克隆细胞；癌基因

　　［中图分类号］　R813　　　［文献标识码］　A

　　［文章编号］　1000-4718(2000)07-0667-03

Progress in the study on establishment and characteristics

　　of viral L6565 cell clone

CHENG Li, YIN Lian-hua, ZHAO Xin-yong

　　(Department of Pathophysiology，Shanghai Medical University, Shanghai, 200032)

　　［A Review］　 The biological characteristics of viral L6565 leukemia cell clone were as follows: (1) The chromosome counts varied 38～114 , and stem cells were 42; (2) Virus particles type A and type C found in the cytoplasm of clone cells; (3) X-C assays were positive, c-myc and c-fos gene overexpressed in clone cells; (4) Differential markers CD4, CD8, CD45R were negative, CD45RO λ were positive; (5) The supernatant of clone cells could induce T or B lymphocytic leukemia/lymphoma and granulocytic leukemia in SSB strain mice. The leukemogenic effect of concentrate supernatant was stronger than non-concentrate supernatant(P＜0.05); (6) The antisense of the c-myc gene induced low expression of c-myc protein, and inhibited the growth of viral L6565 clone cells.

　　［MeSH］　Leukemia; Clone cells; Oncogenes

　　T638和L6565模型是目前国内仅有的两株RNA病毒诱发的白血病，均属于我国天津（T）－上海（S）－遵义（Z）小鼠白血病系统之内^［1，2］。近年来未见T638白血病研究的进一步报道，情况不详。L6565病毒性淋巴细胞白血病是由程立等于1965年建立的瘤株^［3～6］。1986年张雷等^［7］应用L6565白血病小鼠外周血液无细胞提取液感染NIH/3T3细胞，在体外建成了L6565-B₁细胞系，惜已失传。最近，殷莲华等^［8］将L6565白血病小鼠脾脏在灭菌条件下制成细胞悬液后，用RPMI 1640液和10%小牛血清中培养20代后，再用有限稀释法置入96孔板内，并用显微镜检测确定为一个细胞后，继续培养待其增殖至克隆(＞500个细胞)，挑出换成24孔板→6孔板→25　mL培养瓶扩大培养建成含有RNA病毒的L6565细胞克隆株。现对L6565细胞克隆株的生物学、病毒学和基因治疗探讨进行综合报道。

　　一、 L6565细胞克隆株的生物学特性

　　(一) 细胞生长曲线　将L6565克隆细胞制成1×10⁵个/孔置入6孔板，每天计数3孔连续7 d。在培养后第4 d达到培养高峰。最大倍数为7.2倍，以后逐渐下降。

　　(二) 克隆细胞的染色体数目　L6565克隆细胞在分瓶24 h后用秋水仙素0.8 mg/mL处理，按常规制备标本，Giemsa染色，油镜下计数100个中期分裂细胞的染色体。结果表明，克隆细胞的染色体为多倍体，分布范围为38～144条，众数为42，并有A、B、M标记染色体。

　　(三) 克隆细胞的形态学　L6565克隆细胞在显微镜下观察，其形态大多呈圆形或类圆形，少数呈不规则形。细胞大小形态不一，相差悬殊，克隆细胞呈悬浮生长。

　　二、 L6565克隆细胞的病毒学研究

　　(一) 克隆细胞的电镜观察　将培养的克隆细胞离心沉淀后，吸取管底细胞迅速置入1％锇酸液中固定，按常规制备成超薄切片，在H500型电镜下观察，核仁清楚、细胞器丰富，核占细胞3/4左右，形态似幼稚淋巴细胞。细胞质内观察到A型和C型RNA病毒颗粒。

　　(二) X-C检测　将培养良好的X-C细胞，以1×10⁶个/瓶加入到分瓶培养24～48 h的L6565克隆细胞中，再混合培养24 h后，甲醇固定，Giemsa染色。在显微镜下见到合胞现象，表明L6565克隆细胞X-C检测^*阳性，提示被测定的细胞内含有小鼠白血病病毒。X-C细胞对照组为阴性。

　　(三) L6565克隆细胞培养上清液的致白血病作用　1998年胡安群^［11］等将L6565克隆细胞的培养液，在4℃下经1 000 r/min×10 min、10 000 r/min×10 min和100 000 r/min×60 min的不同速度离心后，得到超速离心浓缩上清液(第I组)和未浓缩的上清液(第II组)，按0.2 mL/只给SSB近交系新生乳鼠(＜48 h)皮下注射，分别饲养观察，待其发生白血病时，进行血细胞计数、血液涂片、脏器组织的病理切片，以及从病鼠脾、肝、肾、胸腺和淋巴结提取高分子DNA，用特异的TCR-β基因及IgH基因探针检测细胞DNA TCR-β基因和IgH基因的重排。实验结果:①第I组共注射10只乳鼠，在1年内全部发病，平均潜伏期为5.4月，其中T淋巴细胞白血病/淋巴瘤6例(6/10)，B淋巴细胞白血病/淋巴瘤3例(3/10)，粒细胞白血病1例(1/10)。②第II组共注射10只SSB系乳鼠，在1年内有5只发病，平均潜伏期为9.9月，其中T淋巴细胞白血病/淋巴瘤3例，B淋巴细胞白血病/淋巴瘤2例，其余5例未发病。经过统计处理表明，第I组的发病率高于第II组，而发病的平均潜伏期却明显低于第II组。实验结果证明：L6565克隆细胞培养上清液内含有致白血病活性的RNA病毒。 X-C细胞在1960年由Svoboda^［9］建立的,在体外可长期稳定传代。1969年Klement等^［10］报道了当X-C细胞接触感染了小鼠白血病病毒的细胞会发生细胞融合(合胞化)现象,认为这一现象有特异性,可应用于细胞培养中检测和分离病毒

　　三、 L6565克隆细胞的癌基因和分化标志研究^［12］

　　取L6565克隆细胞制成涂片，或将L6565白血病病鼠的肝、脾、胸腺和淋巴结制成病理切片，应用ABC免疫组织化学技术，进行不同癌基因和分化标志的检测。结果表明，L6565克隆细胞的c-myc和c-fos为强表达，分布在核内，c-myc定位于核的周边区域，c-fos呈弥散状分布；c-jun，ras-p21和c-erb-B₂为弱阳性表达，P53和bcl-2则为阴性。L6565克隆细胞的分化标志: κ轻链型在胸腺和肝为弱阳性，脾和淋巴结为阴性,但λ轻链型则相反，在胸腺和肝为阴性，脾和淋巴结为弱阳性，CD45R和CD4、CD8均为阴性, 表明淋巴细胞尚未分化为成熟细胞，而CD45RO阳性,说明属于记忆型细胞。上述资料提示L6565克隆细胞处于淋巴细胞早期。

　　四、 反义c-myc的抗白血病作用

　　上述研究结果表明，L6565克隆细胞核内有c-myc基因的高表达。赵新永等^［13］从基因治疗角度进行了探讨，针对c-myc基因构建了一个含有小鼠反义c-myc基因的逆转录病毒载体PGNas，并成功地感染了 L6565白血病克隆细胞，获得G418抗性的L6565as细胞，经PCR分析证明，反义c-myc序列已经稳定地整合入L6565as细胞中。研究结果显示：① L6565as细胞生长速度明显减慢；②流式细胞仪分析表明反义c-myc使L6565as阻滞于Go/G₁期(P＜0.05)，而进入S期细胞减少(P＜0.01)；③软琼脂集落形成试验发现L6565as细胞形成克隆数平均为9个/500个细胞，而对照组为27.3和28.7个/500个细胞，彼此差异显著(P＜0.01)；④应用免疫组织化学ABC技术检测表明：L6565as细胞c-myc蛋白为弱阳性，而对照组为强阳性。灰度值t检验表明有显著差异(P＜0.001),表明c-myc基因在L6565白血病的发生中起着重要的作用。

　　病毒性L6565克隆细胞株在体外培养良好，可连续传代，其性质属于淋巴细胞早期。应用电镜观察和X-C检测证明克隆细胞带有白血病病毒，对SSB近交系小鼠有诱发T和B淋巴细胞白血病/淋巴瘤和粒细胞白血病活性。分子生物学方法研究显示，L6565克隆细胞有c-myc和c-fos基因的高表达。构建的反义c-myc基因的逆转录病毒载体PGNas，成功地感染了L6565克隆细胞，并可抑制克隆细胞生长及部分逆转L6565白血病的恶性表型。L6565细胞克隆株的建立，为白血病病毒病因学、发病机制和实验治疗学的研究，提供了良好的体外模型。

　　Tel： 021-64034547

　　［参　考　文　献］

　　［1］　程　立. 实验性T-S-Z白血病系统的研究（1980～1986）［J］. 自然杂志，1987, 10（12）：937～938.

　　［2］　Cheng L, Yin LH. Advances in the study on leukemia strains and leukemia cell lines in China［J］. Chinese J Cancer Res, 1995, 7 (3): 230～234.

　　［3］　上海第一医学院病理学教研组、生物物理学教研组.小鼠L6565型病毒性淋巴细胞白血病生物学特性及电子显微镜观察［J］. 新医学, 1974, 5（3）：103～107.

　　［4］　郑葆芬，单易非，陈伟俊，等. I.小鼠L6565淋巴细胞型白血病病毒的分离［J］. 上海第一医学院学报, 1981, 8（1）：1～5.

　　［5］　郑葆芬，单易非，陈伟俊，等. II.小鼠L6565病毒的逆转录酶活性测定［J］. 上海第一医学院学报, 1981, 8（1）：6～10.

　　［6］　程　立，黄春妹，郑葆芬，等. Ⅲ. 凝胶层析分离的L6565病毒的致白血病活性［J］. 上海第一医学院学报， 1981， 8（1）：11～13.

　　［7］　张雷，郑葆芬，陶鸿根，等. 带有L6565小鼠白血病病毒的细胞系的建立［J］. 病毒学报， 1988， 4：18～22.

　　［8］　殷莲华，庆　欣，赵新永，等. 小鼠L6565白血病克隆细胞株的建立及其生物学特性［J］. 上海医科大学学报，1999，26（增刊）：1～3.

　　［9］　Svoboda J.Presence of chicken tumor virus in sarcoma of the adult rat inoculated after birth with Rous sarcoma tissue［J］. Nature， 1960， 186:980～986.

　　［10］　Klement V,Rowe WP,Hartley JW， et al.Mixed culture cytopathogenicity:A new test for growth of murine leukemia viruses in tissue culture［J］.Proc Nat Acad Sci USA, 1969, 63:753～758.

　　［11］　胡安群， 姜延芳，郑葆芬，等. L6565细胞培养上清液致小鼠白血病研究［J］.待发表.

　　［12］　殷莲华，郑颂国，程　立，等.L6565小鼠白血病病毒癌基因表达的初步研究［J］. 中国病理生理杂志，1997，13（2）：173～175.

　　［12］　赵新永，殷莲华，孔宪寿. 逆转录病毒介导的反义c-myc抗L6565白血病作用的研究［J］. 中华血液学杂志，1999，20（12）：646～647.

［收稿日期］ 1999-10-18

　　［修回日期］ 2000-01-03