难治与复发急性白血病p170和p26与多药耐药关系的分析

中华血液学杂志 1998年第2期第19卷 论　　著

作者：高秀华　张晓辉　乔振华　鹿育晋

　　关键词： 白血病；抗药性，多药；细胞凋亡

　　摘要　目的：探讨p170和p26两种膜蛋白在临床耐药中的作用及相互关系。方法：用流式细胞仪技术检测了39例急性白血病患者骨髓细胞的p170和p26表达率。结果:两者在初治敏感组分别为15.89%±4.41%和17.32%±10.20%，在难治复发组分别为31.02%±14.33%和33.78%±15.97%，两组差别均有显著性(P均＜0.05)，p170与p26的相关性,r=-0.1578, P＞0.5。结论:两者均与临床多药耐药相关，但它们之间无明显相关性,揭示其耐药机制不同。

　　The correlation between p170,p26 and multidrug resistance in refractory/relapse acute leukemia　Gao Xiuhua,Zhang Xiaohui,Qiao Zhenhua,et al.Institute of Hematology,Shanxi Medical University,Taiyuan　030001

　　Abstract　Objective: To explore the role of two membrane proteins,p170 and p26,in clinical drug resistance and their correlation.Methods: The expression of p170 and p26 in bone marrow cells from 39 acute leukemia patients were detected by flow cytometry.Results: The expression ratios of p170 and p26 were 15.89%±4.41% and 17.32%±10.20%, respectively, in previously untreated group, and 31.02%±14.33% and 33.78%±15.97%, respectively, in refractory/relapse group. The difference between the two groups was significant, while there were no correlation between p170 and p26 ( r=-0.1578, P＞0.5).Conclusion:Both p170 and p26 were related to clinical multidrug resistance,but the mechanisms were different.

　　Key words　Leukemia　　Drug resistance　　Apoptosis

　　多药耐药(MDR)是急性白血病化疗失败的主要原因，其机制较复杂,现认为由多药耐药基因(mdr-1)编码的p170的过度表达所介导的耐药是主要的经典途径^［1］;bcl-2是新近发现的一种原癌基因，具有很强的抑制细胞凋亡的能力，迄今有证据表明，某些肿瘤的发生和多药耐药与bcl-2的高表达相关^［2］。为探讨p170和p26两种不同的膜蛋白在白血病临床耐药中的作用及相互联系，我们用流式细胞仪同时检测了39例急性白血病p170和p26，结果分析如下。

材料和方法

　　1　检测对象　39例患者为我院1995年11月～1997年5月住院的患者，男25例，女14例，年龄12～70岁。根据FAB协作组的急性白血病诊断分型标准，急性髓细胞白血病(AML)24例，其中M₁ 1例，M₂ 4例，M₃ 6例，M₄ 4例，M₅ 8例，M₆ 1例；急性淋巴细胞白血病(ALL)L₂ 10例。另外，慢性粒细胞白血病(CML)急粒变(BP)2例，急性浆细胞白血病(APL)1例，多发性骨髓瘤(MM)1例，非霍奇金淋巴瘤Ⅳ期1例。根据复发与难治的诊断标准^［3］，结合疗效，将患者分为两组，初治敏感组24例，复发难治组15例。难治与复发的诊断标准为:①标准的诱导化疗两个疗程不能达完全缓解(CR)；②CR₁后6个月内复发；③CR 12个月后复发再诱导无效；④2次及多次复发。

　　2　检测方法

　　2.1　单个核细胞的制备:髂后上棘抽取2ml骨髓液，置肝素抗凝标本瓶中，缓缓注入到淋巴细胞分离液上层,密度梯度离心20分钟(2000r/min)，吸取上层单个核细胞，用RPMI 1640洗涤3次，2%多聚甲醛固定，备检。

　　2.2　p170、p26免疫荧光样品的制备:用间接免疫荧光标记法。分别将1×10⁶/ml两组细胞以PBS液洗涤2次,弃上清,分别加入1∶100稀释的抗p170和抗p26的单克隆抗体(Dako,USA)各100μl,37℃水浴箱温育30分钟,PBS洗涤，弃上清，分别加入1∶200稀释的羊抗鼠异硫氰酸荧光素(FITC-IgG)(Dako,USA)100μl,37℃温育30分钟,离心洗涤多余的抗体,上机前加PBS液1.0ml,经500目筛网过滤。用非血液病和良性血液病如特发性血小板减少性紫癜、营养不良性贫血等8例患者作正常对照,用PBS液代替所用单抗作阴性对照，用只加FITC-IgG作阳性对照。

　　2.3　流式细胞仪检测方法:采用FACS420型流式细胞仪,激光光源为2W氢离子激光器，输出功率300MV，激光波长为488nm。测量数据和图形输入HP-300 comsort30计算机，应用相应的程序软件进行资料处理。

　　3　统计学处理　方差齐性检验、χ²检验及相关分析。

结　　果

　　1　p170和p26在急性白血病中的表达　p170和p26表达率在初治敏感组分别为15.89%±4.41%和17.32%±10.20%，在难治复发组分别为31.02%±14.33%和33.78%±15.97%，用方差齐性检验，两组p170和p26均有显著差异(P均＜0.05)，两组的总缓解率，用χ²检验，差异显著(P＜0.001),p170和p26在初治敏感组和对照组之间差异无显著性。

　　2　p170和p26与MDR的相互关系　以p170和p26的表达率大于20%为阳性，15例难治与复发患者的p170和p26的表达与MDR的关系见附表。从附表中可见，5例有p170和p26同时表达阳性，7例表达不一致,两者相关性(r=-0.1578，P＞0.5)提示它们之间无明显相关，但它们与MDR均有相关性(r₁=0.831，P₁=0.002；r₂=0.788，P₂=0.04)。

讨　　论

　　急性白血病对化疗发生MDR是临床上较常见的一个棘手问题。对于其复杂的机制，目前的研究方法有的从基因水平，有的从蛋白水平入手。我们用流式细胞仪技术同时检测了mdr-1和bcl-2基因编码的p170和p26，结果发现，p170和p26在难治复发组明显高于初治敏感组，提示它们与临床多药耐药相关。

附表　难治与复发急性白血病p170和p26的表达

　　目前认为p170的耐药机制是p170作为细胞膜上的一个溢出泵，能把细胞内的化疗药物泵出胞外，使细胞内药物浓度降低，进而使细胞免遭化疗药物的杀伤。以往认为它的高表达是获得性的，是反复化疗诱发的结果，但近年来，许多学者对此提出质疑。我们也发现，许多患者在初诊时即有p170的高表达，这揭示了MDR具有内在性。关于p170与急性白血病FAB分型的关系有不同看法，有人认为二者无关，有人则认为p170高表达的病例可能代表了一种特定的肿瘤干细胞。我们发现，在12例难治的AML中，M₄、M₅占明显优势(7例)，与国内其它报道一致^［4］，所以我们认为p170与细胞类型的相关性有待进一步探讨。

　　bcl-2是近年发现的一个与细胞凋亡有关的原癌基因，它可阻断多种细胞毒药物诱发的白血病细胞的凋亡。我们发现，表现临床耐药的难治复发组患者,其p26表达率高于初治敏感组，证实其与耐药相关，机制可能是p26阻断了化疗药物诱发的、借以发挥疗效的白血病细胞的凋亡通路。同时我们还对p170和p26的检测结果作了相关分析，结果提示二者无相关关系，与国外研究报告一致^［5］，说明p26导致耐药的机制可能不同于经典的p170途径，这一结果为解决细胞毒药物耐药提供了一个新思路。

参 考 文 献

　　1　Nooter K,Sonneveld P.Clinical relevance of P-glycoprotein expression in hematologic malignancies.Leuk Res,1994,18:233-243.

　　2　Miyashita T,Reed JG.Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in human leukemic cell line.Blood,1993,81:151-157.

　　3　Hiddemann W,Bucher T.Treatment strategies in acute myeloid leukemia.Blut,1990,6:163-171.

　　4　栾凤君，杨纯正，邵晓枫，等.100例急性白血病患者多药耐药性检测分析.中华肿瘤杂志,1994,16:360-363.

　　5　Lotem J,Saohs L.Regulation by bcl-2，c-myc and p53 of susceptibility to induction of apoptosis by heat shock and cancer chemotherapy compounds in differentiation-competent and defective myeloid leukemic cell.Cell Growth Differ,1993,4:41-47.

(收稿：1997-03-03　　修回：1997-07-08)

(校对：王叶青)