脐血及白血病缓解期骨髓中CD34+细胞筛选及体外扩增
中华血液学杂志 1998年第6期第19卷 研究报告
作者：姜容 韩明哲 赵英新 韩俊领 冯四洲 李成文 严文伟
造血干细胞体外扩增对于造血干细胞移植、基因治疗等研究有着重要的意义。脐血干细胞的有效扩增可望将脐血用于成人移植［1］，可使骨髓移植患者在移植后快速渡过造血危相期,加速造血功能重建［2］，也可为基因治疗提供较多的干细胞量,方便其研究及应用。为此，我们研究了脐血及急性白血病缓解期骨髓(缓解骨髓)中CD34+细胞在不同细胞因子作用下的扩增作用。
材料和方法
1 标本采集 脐血标本来源于天津市第一中心医院。4例脐血样品以40U/ml肝素抗凝,采集量为50～100ml,在采集后12小时内分选细胞。3例骨髓标本来源于我院住院缓解的急性白血病患者,从髂骨采集骨髓,平均采集量为10～20ml,以40U/ml肝素抗凝。
2 CD34+细胞分离 将采集的脐血及肝素用RPMI 1640稀释后用淋巴细胞分离液梯度密度离心分离出单个核细胞(MNC),用RPMI 1640洗涤两次后备用。CD34+细胞的分离采用Immunotech公司提供的单克隆抗体免疫磁珠分离系统,根据操作指南,首先将CD14与抗鼠免疫磁珠(SAM Igbeads)以5μg∶1mg的比例结合,无菌洗涤后再按1mg磁珠与107/ ml MNC的比例将CD14磁珠加入分离后备用的MNC中,在4℃孵育15分钟,然后放置于Cobakt-Samarium magnet磁铁架上静置10分钟,收集未吸附的CD14-细胞悬液,重复吸附洗涤3次,再与1mg经过无菌洗涤的CD34(抗体IMMU133)磁珠与107/ml MNC的比例加入MNC中,混匀后放入4℃孵育15分钟,将样品同样静置于磁铁架上10分钟,弃除未吸附的CD34-细胞,用RPMI 1640+20%FCS混匀吸附于管壁的细胞,重复吸附洗涤3次,最后将吸附于管壁上的CD34+细胞混悬于IMDM培养液中。
3 CD34+细胞的扩增 将CD34+细胞用含20%人AB血清的IMDM液稀释至105/ml细胞浓度,放置于24孔板中,每孔0.5ml,加入不同的细胞生长因子,细胞因子包括SCF 50ng/ml(Sigma公司)、IL-1β 100ng/ml(Sigma公司)、IL-3 100U/ml(Sigma公司)、IL-6100U/ml(Kirin公司)细胞因子组合为：①IL-1；②IL-3；③IL-6；④SCF；⑤IL-1+IL-3；⑥IL-1+SCF；⑦IL-3+SCF；⑧IL-1+IL-3+SCF；⑨IL-3+IL-6+SCF;10对照。在37℃、5%CO2孵箱中孵育1周,第4天时各孔中分别追加各因子半量浓度1次。
4 造血细胞集落半固体培养 造血祖细胞CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix检测方法根据本实验室建立的培养体系,IMDM培养基中含甲基纤维素0.83%,FCS 30%,BSA 1%,L-谷氨酰胺]300ng/ml,GM-CSF 50 ng/ml,IL-3 100U/ml,Epo 3U/ml,CD34+细胞103/ml,上述培养体系混匀后种植于24孔板中,每孔0.5ml,每组样品种植两个孔,在37℃、5%CO2孵箱中培养14天,倒置显微镜下计数CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix集落总数。
结 果
1 脐血及白血病缓解期骨髓中MNC在经过CD14免疫磁珠去除单核、巨噬等细胞成分后,显微镜下观察未见到带有磁珠颗粒的CD14+细胞。经过CD34磁珠吸附选出的CD34+细胞,在显微镜下观察带有CD34磁珠颗粒的占分离细胞的96%～100%。分离后脐血中得到的CD34+细胞占脐血样品中MNC总数的1.50%±0.54%,缓解骨髓中得到的CD34+细胞占MNC的1.32%±0.21%。
2 细胞因子对脐血CD34＋细胞的扩增作用 IL-1、IL-6单独使用的情况下,细胞数基本无变化。而SCF单独使用,细胞数可以扩增10倍以上,SCF联合IL-3及IL-6扩增倍数最高为60.20±16.20倍。
3 脐血CD34+细胞扩增1周后转种半固体培养,2周时CFCs总数的扩增结果与细胞数的扩增相类似。IL-1、IL-6单独使用时CFCs总数无升高。SCF单独使用时CFCs数扩增为12.93±6.10倍,SCF联合IL-3及IL-6扩增倍数最高,为35.48±5.02倍。
4 细胞因子对白血病缓解期患者骨髓CD34+细胞的扩增作用 IL-1、IL-6单独使用细胞数无变化。其它组合的细胞因子组对细胞数有轻微的扩增作用,以SCF+IL-3、SCF+IL-3+IL-1、SCF+IL-3+IL-6组为最高,分别为2.89±0.51，3.83±0.91，3.05±0.73倍。CFCs的扩增倍数与细胞数相似, IL-1及IL-6单独使用CFCs无增加,SCF+IL-3+IL-1及SCF+IL-3+IL-6组CFCs的扩增倍数分别为3.69±0.40及3.75±0.35。
5 扩增后集落形态变化 脐血CD34+细胞在SCF扩增后细胞集落增大,以100个细胞以上的大集落为主。SCF+IL-3组除集落增大外,CFU-Mix比例增多,集落形态比较松散,多见大细胞集落,可见到巨核细胞集落。而在缓解骨髓中,有SCF参入的因子扩增组集落也有增大的趋势,但其增大幅度不如脐血。CFU-Mix比例增高。
讨 论
在我们的实验结果中，骨髓中CD34+细胞的扩增效果不如脐血,其原因可能是缓解的白血病患者在经过反复化疗后处于增殖期的细胞大部分都被化疗药物杀死或杀伤,其扩增效果不如处于造血旺盛期的脐血造血干细胞。但对于自体干细胞移植过程而言,造血干细胞在体外扩增后可能促使部分造血干细胞更快进入增殖周期,加速粒细胞及血小板的恢复,缩短移植后的造血危相期,对于促进患者造血功能重建有一定的意义。从脐血的扩增结果看,CFCs在原有的基础上扩增了35.48±5.02倍,理论上是可以满足成人移植需要的。如何进一步提高干细胞的扩增倍数,降低干细胞的分化还有待进一步的研究。总之,我们的研究结果表明，不同来源的造血干细胞的扩增能力不同,根据不同的扩增能力可以满足不同的科研及临床需要。
参 考 文 献
1 Gabutti V,Timeus F,Ranenghi V，et al.Human cord blood progenitors: kinetics,regulation and their use for hemopoietic reconstitution.Bone Marrow Transplant,1993,12(Suppl 1):84-86.
2 Haylok DN,To LB,Dowse TL，et al.Ex vivo expansion and maturation of peripheral blood CD34+ cells into the myeloid lineage.Blood，1992，80:1405-1412.
(收稿：1997-05-07 修回：1997-12-04)
(校对：仵乾玉)
用户登录 
新用户注册