免疫球蛋白重链胚系基因Cμ在白血病中的异常表达

中华血液学杂志 1998年第7期第19卷 论　　著

作者：郭梅　董陆佳　黄士敏　贾蜀琼　卢淑娟　骈淮媛　姚波　王桂林　李银太　王海涛

单位：100039　北京，北太平路医院血液科（郭梅、董陆佳、黄士敏、贾蜀琼、卢淑娟、骈淮媛、姚波、王桂林 ）；军事医学科学院微生物流行病学研究所（李银太、王海涛）

　　关键词： 白血病；免疫球蛋白重链胚系基因Cμ；免疫表型

　　摘要　目的：探讨IgH胚系Cμ基因表达在白血病发病中的意义。方法：应用逆转录-聚合酶链反应对各型急、慢性白血病59例63份骨髓标本进行免疫球蛋白重链(IgH)胚系Cμ基因转录本检测。结果：在多种急、慢性白血病亚型中均可以检出胚系Cμ链基因的转录。在急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)中分别为65.4%和75.0%；而慢性粒细胞白血病急变期4例和慢性淋巴细胞白血病2例均呈阳性。IgH胚系基因Cμ转录本阳性患者中HLA-DR阳性表达者占80.0％；而在AML伴Cμ(＋)者，HLA-DR阳性表达者占92.9％。对照组均为阴性。结论：相当多的髓系白血病,其白血病细胞系似源于髓系/淋巴系共同干细胞水平，或伴有不可逆性基因重排程序错误及淋巴系、髓系系列间不稳定性。

　　Aberrant expression of immunoglobulin germline gene Cμ in leukemias　Guo Mei,Dong Lujia,Huang Shimin,et al.Beijing North Taiping Road Hospital,Beijing　100039

　　Abstract　Objective:To investigate the significance of immunoglobulin germline gene Cμ expression in leukemias.Methods:Immunoglobulin germline gene Cμ transcripts in 63 bone marrow samples from 59 leukemia patients were examined by RT-PCR.Results:Germline Cμ transcripts could be identified in 17 of 26 AML,9 of 12 ALL,4 CML-BC and 2 CLL patients.HLA-DR was expressed in 80% Cμ(+)patients and in 92.9% Cμ(+) AML patients.In 10 normal bone marrow or peripheral blood samples Cμ transcripts were undetectable.Conclusion:Leukemogenesis in most acute leukemia may originate from the common progenitors of early B-lymphoid and myeloid cells.

　　Key words　Leukemia　　IgH germline Cμ gene　　Immunophenotype

　　近年来,与白血病发病机制密切相关的胚系基因活化揭示了白血病基因水平异常的复杂性、多样性，鉴于某些胚系基因在白血病发病机制、诊断分型以及预后中的重要作用，我们选用免疫球蛋白重链（IgH）胚系Cμ链特异性引物(该引物仅特异性扩增胚系Cμ基因3′端增强子末端和Cμ第1外显子之间的接合部序列，在髓系白血病异常表达的频率高^［1］)，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测法对急、慢性白血病59例63份骨髓样本的胚系基因Cμ转录进行检测，结果如下。

病例和方法

　　1　患者　63份骨髓标本取自急、慢性白血病患者59例,男40例,女19例,中位年龄34(3～70)岁。急性髓系白血病(AML)标本26份来自23例患者，其中M₂ 6份来自4例患者，M₃ 5份来自5例患者，M₄ 9份来自9例患者，M₅ 6份来自5例患者；急性淋巴细胞白血病(ALL)标本12份来自11例患者；慢性淋巴细胞白血病(CLL) 2份来自2例患者；骨髓增生异常综合征(MDS)2份来自2例患者；慢性粒细胞白血病(CML) 21份来自21例患者, 其中CML慢性期(CML-CP) 16例, CML加速期(CML-AP) 1例, CML急性髓性变期(CML-BC) 4例。所有病例诊断与分型均按FAB标准, 大部分病例同时结合免疫表型进行诊断分型。献髓员或献血者10名作为对照。

　　2　免疫表型分析　采用间接免疫荧光标记技术，利用免疫荧光显微镜进行检测。单克隆抗体B系: CD₁₀、CD₁₉、CD₂₀; T淋巴系: CD₂、CD₇;髓系CD₁₅、CD₃₃;早期造血干细胞系:HLA-DR、CD₃₄、CD₃₈。判断阳性的标准为阳性细胞大于20％。

　　3　引物的合成　参考文献［1,2］合成一对IgH胚系Cμ链引物。引物序列A:5′-CTGGCTGCTCAGCCCCAGCCC-3′， 反义引物B:5′-CTGATGTCAGAGTTGTTCTTG-3′，以反义引物B为逆转录（RT）引物，产生245bp片段。上述引物委托军事医学科学院放射医学研究所合成。

　　4　单个核细胞分离和细胞总RNA提取　经肝素抗凝骨髓或外周血2ml用Ficoll液分离单个核细胞,用1×PBS液反复洗涤2～3次, 镜下计数，制备成2×10⁶/ml的单个核细胞悬液。细胞总RNA提取试剂为军事医学科学院微生物流行病研究所李银太老师提供。提取方法：将2×10⁶/ml单个核细胞悬液0.5ml加入等量裂解液，充分混匀静置30分钟后4 ℃、 8000r/min离心2 分钟,去上清吸干，加入0.5 ml洗涤液充分混匀，4℃、8000r/min离心1分钟，去上清吸干，反复洗涤2～3次，干燥后-20°C贮存备用。或将上述经干燥后的核酸溶于0.1％ DEPC 50μl中,溶解10分钟后取上清可进行RT反应。

　　5　cDNA合成及PCR扩增　反应条件和方法均在实验前进行优化。 RT反应体系20μl，含AMV逆转录酶10U,RNA酶抑制剂(RNasin)10U, dNTP终浓度为200 μmol/L, 自配10×反应缓冲液2μl, 引物采用反义引物B，终浓度为0.25μmol/L，其余体积用经提取干燥后溶于0.1％DEPC 50μl的核酸溶液补充。反应条件：42℃恒温水浴40分钟。RT反应获得cDNA作为PCR第1轮反应的模板,引物为5′-A和3′-B，进行PCR。反应条件为94 ℃预变性5分钟，94℃变性40秒,55℃退火40秒，72℃延伸45秒，循环30次，最后72℃延伸5分钟。反应体系为20μl,含Taq DNA聚合酶1U, dNTP终浓度为 200μmol/L， 10×缓冲液2μl，A、B引物终浓度均为0.25μmol/L, cDNA 5 μl，其余为0.1％DEPC。第2轮反应取第1轮产物1μl, 其余条件同第1轮。扩增后产物10 μl加样于1.5％琼脂糖凝胶(含EB)进行电泳，110V电压下进行40分钟，以pBR322/Hae Ⅲ作为分子量标准,在紫外灯下观察电泳结果。

结　　果

　　1　RT-PCR检测IgH胚系Cμ基因转录　急、慢性白血病59例63份骨髓样本中有32份检出IgH胚系Cμ基因转录，总阳性率为50.8%(表1)。26份AML患者骨髓标本中17份可以检出IgH胚系Cμ基因转录，阳性率为65.4％(患者一般临床资料、免疫表型及IgH胚系基因表达见表2)。IgH胚系Cμ基因转录在M₂、M₄和M₅中检出率均较高,而在5例M₃患者中检测结果均为阴性。IgH胚系Cμ基因转录阳性AML患者其免疫分型中HLA-DR大部分有较高水平表达(92.9％),提示此类白血病克隆起源较早。在12份ALL患者骨髓中9份B-ALL(75.0％)可检出此基因转录；21例CML患者中只有4例CML-BC患者检出其转录，16例CML-CP和1例CML-AP样本均未检出Cμ转录本；2例MDS(RA、RAEB各1例)患者均为阴性。对照组10名正常人的骨髓和外周血检测结果均为阴性。AML-M₃，CML-CP未能检出Cμ转录本，推测系由于其恶性细胞分化成熟程度高,所具有的胚系基因在向髓系分化过程中已被修饰，处于静止状态。MDS患者2例均为阴性，但尚不足以结论。部分患者RT-PCR检测结果如图1所示。

表1　急、慢性白血病IgH胚系Cμ转录

表2　23例AML患者一般临床资料、免疫分型及IgH胚系Cμ基因转录情况

　　*微量残留白血病细胞检测的患者

　　M为pBR322/HaeⅢ梯形标准DNA分子量参照物；1～5分别为AML M₂、M₄、M₅，CML-BC，B-ALL IgH胚系Cμ基因阳性转录本；6为正常人的阴性对照；7和8为白血病患者阴性检测结果。扩增出的阳性转录本分子量为245bp

　　 图1　1.5％琼脂糖凝胶电泳结果

　　2　检测灵敏度　以10⁶个细胞为起点，将骨髓中幼稚细胞大于95％且IgH链胚系Cμ基因转录(＋)的骨髓单个核细胞按1∶10进行连续梯度稀释, 分别进行RT-PCR扩增。结果在10^-5仍可辨别出阳性扩增条带，提示实验灵敏度可达10^-5(图2)。为确保结果的可靠性，我们每次实验时均设立阴性、阳性对照，严格操作程序。

　　3　比较分析了急性白血病38例（AML 23例, ALL 11例，CML-BC 4例）IgH胚系Cμ基因异常表达与治疗反应的关系，发现两者有显著的联系。IgH胚系Cμ基因表达阳性的29例中，在接受2个疗程化疗后，7例获完全缓解(CR)，22例未缓解(NR)；在IgH胚系Cμ阴性的9例患者中，有7例获CR，2例NR，两组间有显著差异（P＜0.01）。提示IgH胚系Cμ基因表达阳性的病例反应差，缓解率低。

　　m为pBR322/HaeⅢ梯形标准DNA分子量参照物；1～6分别为1∶10连续梯度稀释的PCR检测结果；7为正常人阴性对照。扩增出的阳性转录本分子量为245bp

　　 图2　测定敏感度电泳结果

　　4　在微量残留白血病细胞检测方面的尝试　我们对AML中的骨髓缓解患者2例进行动态检测IgH 胚系Cμ基因转录情况，发现其中1例患者由阳性转为阴性，这1例患者骨髓一直处于CR状态，而另1例持续阳性，患者在检测3个月后骨髓复发。对ALL中1例CR患者进行检测，结果为阳性，该患者在检测6个月后因复发死亡。以上结果提示IgH胚系Cμ基因在微量残留白血病细胞检测方面可能有意义，但由于检测例数及临床观察时间有限，其检测的意义需要进一步观察和探讨。

讨　　论

　　IgH胚系基因重排在早期B细胞分化发育过程中具有重要意义,而Cμ表达也被认为是早期B细胞分化标志^［2～4］。近年来一些研究表明，Cμ是髓系、淋巴系祖细胞向下级定向祖细胞分化发育过程中短暂过渡时期的基因标志^［5,6］。正常情况下，该类祖细胞极少,所具有的胚系基因在向髓系分化发育过程中被修饰,因而处于静止状态。但在细胞恶变及异常克隆扩增中得以蓄积,故胚系基因可出现异常高表达^［1］。

　　据文献［1］报道,Cμ基因高表达既可见于B淋巴细胞白血病亦可见于髓系白血病,但基因水平检测结果提示髓系白血病的Cμ基因重排尚有如下特点：①Cμ转录子序列短，在1.4 ～1.8kb,而Cμ成熟转录序列全长为2.4～2.7kb, 故髓系白血病转录子被称为不育性转录子,通过常规Northern杂交检测易于识别；②Cμ转录子不含有可扩增的增强子序列、S序列以及完整的5′端序列，此种缺失又依髓系细胞分化程度而有所差异,起源于越早期造血干(祖)细胞水平的白血病细胞其Cμ转录子序列越接近于早期B细胞；③3′端接合部序列变异多见。有学者近期采用一系列探针和引物对Cμ基因序列进行检测和筛选,结果提示在髓系白血病Cμ序列有多种变异,推测是细胞系特异性修饰因子在髓系细胞发育过程中进行多重基因序列修饰整合的结果^［1］。

　　我们对各型急、慢性白血病59例中的63份骨髓样本进行IgH胚系Cμ基因转录检测,证实在75.0％的ALL和65.4％的AML中均有阳性检出，CLL 2例和CML-BC期4例患者标本中也获阳性发现,提示白血病伴有Cμ基因表达比预想的常见得多,不可逆性基因重排程序错误或系列不稳定性在髓系白血病颇为常见。对照组10名正常骨髓(外周血)均为阴性结果,与国外报道一致^［5～7］。各型白血病, 尤其是髓系急、慢性白血病具有如此高频率的IgH胚系Cμ基因表达有力地提示相当多的病例,其白血病细胞可能源于髓系/B淋巴系干细胞水平,或其基因重排具有淋巴系、髓系系列不稳定性。

　　部分IgH胚系Cμ转录的患者中HLA-DR亦有较高水平的表达, 支持此类白血病源于早期造血干(祖)细胞水平。这一结果与Williams等^［1］报道的Cμ表达与HLA-DR和CD₃₄表型之间无相关性的结论不同。胚系Cμ转录在髓系白血病中具有如此高频率的表达, 反映了残留胚系基因的存在和活化。提示某些类型髓系白血病可能与早期B淋巴细胞白血病具有共同或相近的白血病克隆源性。

参 考 文 献

　　1　Williams L, Moscinski LC， Medveczky PG. Immunoglobulin germline μ transcripts in acute myelogenous leukemia cells vary in splicing pattern and are heterogenous.Leukemia，1995，9:2016-2022.

　　2　Neale GAM， Kitchingman GR. mRNA transcripts initiating within the human immunoglobulin mu heavy chain enhancer region contain a non-translatable exon and are extremely heterogeneous at the 5′ end. Nucl Acids Res， 1991, 19:2427-2433.

　　3　Buccheri V, Mihaljevic B,Matutes E, et al. mb-1: a new marker for B lineage lymphoblastic leukemia. Blood, 1993, 82:853-857.

　　4　Sandlund JT, Neckers LM, Schneller HE, et al. Theophylline induced differentiation provides direct evidence for the deregulation of c-myc in Burkitt′s lymphoma and suggests participation of immunoglobulin enhancer sequences. Cancer Res, 1993, 53:127-132.

　　5　Palumbo A, Minowada F, Erikson J, et al. Lineage infidelity of a human myelogenous leukemia cell line. Blood, 1984, 64:1059-1063.

　　6　Ha K, Minden M, Hozumi N, et al. Immunoglobulin gene rearrangement in acute myelogenous leukemia. Cancer Res, 1984, 44:4658-4660.

　　7　Guo M,Dong LJ, Huang SHM, et al. Immunoglobulin germline μ transcripts:a myeloid and B-lymphoid common gene program. Blood, 1996,88:369a.

(收稿：1997-08-08　　修回：1997-12-04)

(校对：仵乾玉)