TPA对人白血病传代细胞系中IL-1β mRNA表达的影响
中华血液学杂志 1998年第11期第19卷 研究报告
作者:鲍永利 徐蔼复 杨贵贞 于永利
单位:130021 长春,白求恩医科大学基础免疫学教研室(鲍永利、杨贵贞、于永利);吉林省人民医院血液科(徐蔼复)
白细胞介素(IL)-1β不仅对免疫系统,而且对造血、神经、内分泌等多个系统发挥多种生物学效应[1],是一个在机体防御方面起中心作用的细胞因子。IL-1β的异常表达往往与某些疾病密切相关,尤其在白血病的发生、发展中起着重要的作用。我们研究了乙酰豆寇佛波酯(TPA)对人单核细胞白血病传代细胞系U937细胞、人红白血病传代细胞系K562细胞、人T淋巴细胞白血病传代细胞系MT-2细胞中IL-1β mRNA表达的影响,从而探讨IL-1β与白血病细胞分化的相关性。
材料和方法
1 材料 TPA为Sigma公司产品;U937、MT-2、K562细胞株由本实验室传代培养;随机引物标记试剂盒购自Promega公司;α32P-dCTP购自福瑞公司;IL-1β PGEM4Z质粒为本实验室构建。
2 细胞培养 将U937、MT-2、K562细胞用含10%小牛血清的IMDM培养液传代培养,待生长良好时用无血清IMDM培养,并分组刺激。
3 Northern blot
3.1 细胞总RNA的提取及转膜:收集经过刺激培养的细胞,用PBS洗涤后用异硫酸胍法提取细胞总RNA,然后进行甲醛变性电泳,电泳后转膜,将膜于80℃烤2小时,密封于塑料袋中于-20℃保存。
3.2 探针的标记:IL-1β PGEM4Z重组质粒为本室自制,方法见文献[2]。将其用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切,得到IL-1β cDNA片段,片段大小为388bp;γ-actin片段的获得是用γ-actin引物(上游端引物为5′-GATGGCCAGGTCATCACCATTGGC-3′,下游端引物为5′-GAAGGTGGACAGTGAGGCCAGGAT-3′)PCR扩增U937细胞总cDNA,得到γ-actin片段大小为327bp,将上述两个片段分别用随机引物法标记上α32P-dCTP[3]。
3.3 杂交、洗膜及放射自显影:将膜放入杂交袋中,加入30ml预杂交液(6×SSC ,0.25%脱脂奶粉,0.1%SDS,20mmol/L焦磷酸钠)。60℃摇动水浴2小时。预杂交后加入IL-1β cDNA探针,60℃摇动水浴18小时。杂交后将膜取出,置于65℃的2×SSC,0.1%SDS中洗膜,洗4次,每次30分钟,洗后将膜晾干,于暗室压X线片,-30℃曝光48小时后,冲洗X线片。将同一张膜上的探针于95℃洗脱后,再与γ-肌动蛋白cDNA探针以同样的方法进行杂交。
结 果
1 TPA刺激U937细胞中IL-1β mRNA表达的时间效应 将U937细胞分别用TPA刺激3,6,9,12小时,提取总RNA,转膜,行Northern blot杂交,结果显示刺激12小时表达量较高,9小时表达量次之,6小时表达量更少,3小时几乎无表达,未用TPA刺激的对照组不表达IL-1β mRNA。
2 TPA诱导U937、K562、MT-2细胞中IL-1β mRNA的表达 将U937、MT-2、K562分别分为无刺激的对照组及TPA刺激组(200U/ml),每组1×108个细胞,培养12小时后,提取总RNA,并进行Northern blot杂交,结果如附图所示,U937细胞,MT-2细胞,K562细胞在无刺激时均无IL-1β mRNA的表达,用TPA刺激后IL-1β的表达量明显增加。
1:U937细胞mRNA(无TPA刺激);
2:TPA(200ng/ml)刺激后U937细胞mRNA;
3:MT-2细胞mRNA(无TPA刺激);
4:TPA(200ng/ml)刺激后MT-2细胞mRNA;
5:K562细胞mRNA(无TPA刺激);
6:TPA(200ng/ml)刺激后K562细胞mRNA
附图 TPA刺激后U937细胞、MT-2细胞及K562细胞中
IL-1β mRNA的表达
讨 论
IL-1是大家比较熟知的细胞因子,其包括IL-1α和 IL-1β两种,在人体主要以表达IL-1β为主。IL-1不仅对免疫系统而且对神经、内分泌等多个系统都起着极其重要的作用,IL-1的异常表达与许多疾病都是密切相关的,如再生障碍性贫血常伴有IL-1的异常低表达;急性、慢性白血病细胞本身可分泌IL-1,此IL-1可刺激这两种细胞产生一些生长因子,这些因子又促进这两种细胞的增殖。如果用IL-1ra阻断IL-1活性,则白血病细胞的增殖受到抑制[4]。
TPA作为一个诱变剂,它可使人单核细胞白血病传代细胞进一步分化成熟。我们发现在TPA刺激的人单核细胞白血病传代细胞系U937细胞中IL-1β mRNA的转录明显增强,而且动态观察结果表明IL-1β在刺激后即开始上升,12小时达高峰,另外,TPA还可不同程度地诱导人红白血病传代细胞系K562细胞及人T淋巴细胞白血病传代细胞系MT-2细胞的IL-1β mRNA的表达,此结果说明,在TPA诱导白血病细胞分化的过程中IL-1β可能起着一定的作用。
参 考 文 献
1 白川文彦,齐藤和义,安部美穗子,他. IL-1遗传子の转写调节机构. 临床免疫,1993,25:930-936.
2 鲍永利,杨贵贞,于永利. 人IL-1β PCR-cDNA片段的克隆及鉴定. 中国免疫学杂志,1994,10:209.
3 萨姆布鲁克 J,弗里齐 EF,曼尼阿蒂斯 T,著. 金冬雁,黎孟枫译. 分子克隆,1992,10:502-504.
4 Estrv Z. Suppression of chronic myelogeneous leukemia colony growth by interleukin-1(IL-1) receptor antago-nist solube IL-1 receptor: a novel application for inhibitors of IL-1 activity. Blood, 1991, 78:1476-1480.
(收稿:1997-06-27 修回:1997-12-04)
(校对:张吉贤)