bcl-2基因表达在慢性粒细胞白血病急变中的意义
中华血液学杂志 1999年第1期第20卷 论著
作者：隋雪梅 苏力 褚建新 赵钧铭 王淑萍
单位：300020 天津, 中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室
关键词： 白血病，髓样，慢性；白血病，髓样，进展期；基因，bcl-2
【摘要】 目的 探讨bcl-2基因表达在慢性粒细胞白血病(CML)急变中的生物学意义。方法 采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶免疫复合物方法和地高辛标记探针原位杂交技术检测各期CML患者60例新鲜骨髓标本中BCL-2蛋白和bcl-2 mRNA的表达，并对其中19例标本进行流式细胞术分析骨髓细胞凋亡率及细胞周期。结果 初诊和治疗后CML中bcl-2基因表达相近，但明显低于急变时。bcl-2 mRNA表达与蛋白表达基本一致。bcl-2基因高表达与CML患者外周血血红蛋白、血小板、幼稚细胞及骨髓不成熟细胞比例相关。加速/急变期CML细胞凋亡率明显低于慢性期，但细胞周期无明显变化。结论 CML急变时bcl-2基因表达增高，骨髓细胞凋亡率降低，这些现象部分地阐明了CML急变预后不良的机制，也为CML急变的早期诊断和治疗提供了实验依据。
Expression of bcl-2 gene in the evolution of chronic myelogenous leukemia to blast crisis and its implication SUI Xuemei, SU Li, CHU Jianxin, et al. Institute of Hematology, State Key Laboratory of Experimental Hematology, CAMS and PUMC, Tianjin 300020
【Abstract】 Objective To investigate the expression of bcl-2 gene and cell apoptosis and cell cycle in bone marrow of chronic myelogenous leukemia (CML).Methods APAAP assay and in situ hybridization were used for the expression of BCL-2 protein and bcl-2 mRNA in fresh bone marrow samples from 60 cases of CML. Flow cytometry was used to assess the extent of apoptosis and cell cycle percentage.Results The expression of bcl-2 gene had no statistical difference between CMLs at presentation and in chronic phase, but was much lower in blast crisis (P＜0.05). The percentage of bcl-2 mRNA positive cells was consistent with BCL-2 protein expression. In addition, BCL-2 protein was related to the Hb levels, BPC,and immature cells in the peripheral blood and bone marrow.Notably, the extent of apoptosis in accelerated phase/blast crisis was much lower than that in chronic phase(P=0.028), while the cell cycle had no difference.Conclusion High level of bcl-2 gene expression and low extent of apoptosis in bone marrow cells of CML might partially be the mechanism of poor prognosis of blast crisis, and this provides a new experimental basis for early diagnosis and treatment of CML blast crisis.
【Key words】 Leukemia, myeloid, chronic Leukemia, myeloid,aggressive-phase Gene, bcl-2
我们采用免疫酶标和原位杂交技术检测CML患者骨髓细胞中bcl-2基因的表达,流式细胞术检测细胞凋亡情况,以期从bcl-2的抗凋亡角度对慢性粒细胞白血病(CML)急变的发生有所了解。
材料和方法
1 病例 中国医学科学院血液病医院确诊的门诊及住院CML患者,共60例。其中慢性期初诊未治疗19例,治疗后14例,加速期(AP)7例,急变期(BC)20例。男女比例为41∶19,年龄8～69岁,平均43岁。
2 主要试剂 bcl-2兔抗人单抗(北京中山生物技术公司),碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)免疫组化试剂盒(本所产品),地高辛DNA标记和检测试剂盒(德国宝灵曼公司),碘化丙锭(PI)(Sigma公司),含bcl-2基因的pSFFV-Neo质粒(由中国医学科学院肿瘤研究所吴教授赠送)。
3 标本制作 采取患者骨髓,肝素抗凝,按常规用淋巴细胞分离液分离并收集单个核细胞,取少量作离心涂片,镜检原始、幼稚粒细胞比例大于0.800。一部分分别用甲醇、丙酮(按1∶1配制)和体积分数为4％的多聚甲醛固定,待作免疫组化和原位杂交; 一部分加入体积分数为75％的乙醇中, 4℃固定18小时以上,待作流式细胞术。
4 BCL-2蛋白表达的检测 采用APAAP免疫酶标法［1］检测BCL-2蛋白的表达。阳性细胞的胞浆中显示红色颗粒或弥散状物质。
5 bcl-2 mRNA表达的检测 从pSFFV-Neo质粒中酶切下bcl-2基因片段约900bp,按地高辛试剂盒说明标记dUTP-地高辛,与待测细胞作原位杂交。细胞经抗地高辛酶联免疫反应和硝基四氮唑蓝(NBT-BCIP)显色后在显微镜下观察。阳性细胞呈紫蓝色,空白对照无杂交信号。
6 流式细胞术 取4℃下乙醇固定的细胞,离心弃去上清,PBS洗涤后,以50μl PI溶液(50ng PI+100ml H2O,4℃)染色30分钟,用流式细胞仪分析细胞凋亡率和细胞周期。
7 结果判定 根据镜检染色阳性细胞百分率,并依据细胞染色强度计算阳性指数［2］。
8 统计方法 BCL-2表达与临床参数分组进行t检验,采用SPSS软件统计。
结果
1 bcl-2基因在CML骨髓细胞中的表达
1.1 47例CML患者BCL-2蛋白表达的观察结果见表1。
表1 CML各期患者BCL-2蛋白表达的阳性率和阳性指数(
±s)
| 组别 |
例数 |
阳性率(％) |
阳性指数 |
| 慢性期未治疗组 |
17 |
24.8±14.2 |
25.4±13.9 |
| 慢性期治疗后组 |
7 |
20.3±7.2 |
21.6±7.9 |
| 加速期组 |
5 |
62.2±7.5 |
71.8±12.4 |
| 急变期组 |
18 |
71.8±11.4 |
86.6±15.4 |
由表1可见,慢性期未治疗和治疗后患者BCL-2蛋白平均阳性率差异无显著性(P=0.44);加速期和急变期患者BCL-2蛋白平均阳性率差异也无显著性(P=0.094);但加速期和急变期患者BCL-2蛋白平均阳性率和阳性指数均明显高于初诊CML和治疗后CML(t=11.15,P＜0.001)。
1.2 20例CML患者bcl-2 mRNA表达：急变期患者也明显高于未治疗的CML患者(表2)。
表2 bcl-2 mRNA 在CML各期中的表达(±s)
| 组别 |
例数 |
阳性率(％) |
阳性指数 |
| 慢性期未治疗组 |
10 |
23.7±5.7 |
24.6±5.9 |
| 急变期组 |
10 |
58.5±19.0 |
78.8±39.2 |
| t值 |
|
5.549 |
| P值 |
|
＜0.001 |
1.3 慢性期(未治疗)CML与急性变者的BCL-2蛋白和bcl-2 mRNA表达基本一致(P＞0.5)。
2 bcl-2基因表达的形态表现
BCL-2蛋白主要出现于不成熟粒细胞和淋巴细胞,在一些巨核细胞亦可见,且表达较强。BCL-2蛋白阳性产物多数在胞浆中呈不同程度的弥散状分布,少数呈团块状或颗粒状,有的出现于核膜上。bcl-2 mRNA主要出现于胞浆中,呈紫蓝色颗粒状或絮状沉淀。
3 bcl-2基因表达与CML临床特点的关系
按文献［3］,以BCL-2蛋白阳性值20％为界,将患者分为两组,发现bcl-2基因表达与外周血血红蛋白(t=2.728,P=0.001),血小板计数(t=1.980,P=0.027),幼稚粒细胞数(t=2.074,P=0.039)及骨髓原始、幼稚粒细胞数(t=2.666,P=0.03)均相关,而与白细胞数无关(P=0.819)。结果见表3。
表3 BCL-2蛋白阳性率与CML临床特点的关系(±s)
| BCL-2蛋
白阳性率 |
例数 |
年龄
() |
性别 |
WBC
(×109/L) |
RBC
(×1012/L) |
Hb
(g/L) |
BPC
(×109/L) |
外周血
幼稚粒细胞 |
骨髓原始、
幼稚粒细胞 |
| 男 |
女 |
| ≤20% |
13 |
39 |
9 |
4 |
58.8±54.9 |
4.0±0.7 |
130.8±14.2 |
473.2±344.9 |
0.185±0.126 |
0.501±0.098 |
| ＞20% |
30 |
41 |
18 |
12 |
64.5±78.7 |
3.1±1.0 |
103.8±34.5 |
263.3±242.0 |
0.298±0.213 |
0.641±0.164 |
4 CML骨髓细胞的流式细胞仪检测
分析了19例CML患者骨髓细胞凋亡率,加速/急变期CML明显低于慢性期CML(P=0.028),有的慢性期患者出现明显的凋亡峰,而进展期患者则很少出现。慢性期CML与加速/急变期CML的细胞周期未发现有统计学差异(表4)。
表4 各期CML患者骨髓细胞凋亡和细胞周期百分率(±s)
| 组别 |
例数 |
凋亡细胞
(％) |
细胞周期(%) |
| G0/G1 |
S |
G2/M |
| 慢性期 |
9 |
11.4±9.2 |
59.9±14.4 |
24.6±12.1 |
15.4±10.0 |
| 加速/急变期 |
10 |
3.9±4.0 |
65.4±12.4 |
15.1±9.9 |
19.5±14.2 |
讨论
bcl-2基因是1984年Tujimoto等在滤泡性淋巴瘤染色体t(14；18)断裂点发现的凋亡抑制基因,它可使细胞寿命延长,生长失去平衡,造成细胞数目的积累,在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。bcl-2基因在多种恶性血液系统疾病中均有表达,但在CML中的研究则较少报道［3-7］。
我们比较了CML不同时期bcl-2表达情况、凋亡程度以及细胞周期的变化。发现bcl-2表达水平在加速/急变期明显高于慢性期。Delia等［4］观察了7例CML,bcl-2阳性细胞＞20％仅1例,而3例急变期患者均＞20％。按Delia等的标准划分,本研究中初诊CML 17例，＞20％ 8例;治疗后慢性期CML 7例，＞20％者3例; 而加速/急变期CML患者35例全部＞20％。最近Handa等［6］采用流式细胞术检测了43例CML患者的Bcl-2蛋白表达,加速/急变期患者明显高于慢性期患者。
CML急变时bcl-2基因表达增高的原因,根据Handa等的分析,bcl-2表达主要出现于淋巴细胞和原始细胞,成熟细胞不表达BCL-2蛋白,单核细胞表达极低。从群体水平考虑,表达bcl-2的细胞随疾病进展会增多。如果不计算原始细胞,则bcl-2表达水平在CML各期无明显区别。因而认为,加速/急变期患者bcl-2表达的升高,反映了表达BCL-2蛋白阳性原始细胞数量上的扩增。本研究结果也显示,随CML病情进展，bcl-2基因表达增高,外周血幼稚粒细胞及骨髓原始、幼稚粒细胞也升高。但我们认为还不能排除其它引起bcl-2高表达的因素,因为CML急变时的bcl-2基因表达,不仅高于初诊CML,而且也高于初诊急性粒细胞白血病。
我们采用地高辛标记bcl-2探针的原位杂交方法检测了20例CML患者bcl-2 mRNA的表达情况,发现bcl-2 mRNA的表达水平在初诊CML和加速期CML也有明显不同,bcl-2 mRNA阳性率均值分别为23.7％和58.5％,差异有显著统计学意义(P＜0.001)。我们的观察表明,bcl-2 mRNA的表达与BCL-2蛋白表达的趋势类似。有的作者认为bcl-2 mRNA与蛋白表达存在不一致性,BCL-2蛋白阴性细胞中可出现高水平的bcl-2 mRNA,认为与转录后调控机制有关［8］。因此,应同时检测BCL-2蛋白和bcl-2 mRNA,以全面判定bcl-2基因表达水平，但我们的资料显示单项BCL-2蛋白表达增高仍具有重要的临床意义。
为了观察bcl-2基因表达与细胞凋亡和细胞周期的关系,我们分析了CML骨髓单个核细胞的凋亡程度及细胞周期变化。发现加速/急变期CML的凋亡率明显低于慢性期CML(P＜0.05),有些慢性期CML骨髓细胞出现明显的细胞凋亡峰。这可能与bcl-2基因的抗凋亡功能有关,随着CML进展,bcl-2基因表达水平增高,其抑制细胞凋亡的作用加强。但Handa等［6］的观察结果没有发现二者之间有明显差异,认为由于分析病例较少,尚不能排除细胞凋亡率降低在CML恶性转化中所起的作用。细胞周期分析的结果表明各期细胞所占比例无明显差异。看来,CML急变时细胞增殖速率无明显加快,这对认识CML急变细胞的特性是十分重要的。
根据以上研究结果,CML急变时出现的bcl-2基因表达增高,骨髓细胞凋亡率降低,提示bcl-2基因在CML急变过程中具有重要的意义,它不仅可部分阐明CML预后不良的机制,而且还可为CML急变的早期诊断和治疗提供新的实验依据。
参考文献
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收稿：1998-07-09 修回：1998-09-14
(校对：张志方)
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