急性髓系白血病细胞外基质纤连蛋白、基膜连接蛋白的分析及临床意义

中华血液学杂志 1999年第1期第20卷 论著

作者：林艳娟　吕联煌　陈志哲　李觉民

单位：350001　福州，福建医科大学附属协和医院、福建省血液病研究所

　　关键词： 细胞外基质；白血病，髓样，急性；纤连蛋白类；连接蛋白类

　　【摘要】　目的　探讨细胞外基质纤连蛋白(Fn)、基膜连接蛋白(Lm)与白血病细胞生长、分化之间的关系。方法　应用免疫荧光法观察18例急性髓细胞白血病(AML)骨髓细胞长期培养(LTBMC)细胞外基质Fn、Lm含量的变化。结果　①9例获独立生长的AML(AMLsm)骨髓细胞在培养的1～3周，Fn、Lm含量均显著低于9例未获独立生长的AML(AMLnsm)；②在培养的第3周，8例AMLnsm幼稚细胞比例可降至0.05以下，而7例AMLsm未能降至0.05；③各周幼稚细胞比例分别与Fn、Lm含量相关分析示：第0～8周正常对照均呈正相关，0～4周AMLnsm均呈负相关而AMLsm仅Fn组呈负相关。结论　Fn和(或)Lm的改变在AML发生、发展的某一环节起重要作用。此外，Fn、Lm含量在AMLsm与AMLnsm之间不同，这对LTBMC应用于AML自身骨髓体外净化病例的选择可能有参考价值。

　　Analysis of fibronectin and laminin in the extracellular matrixes of acute myeloid leukemia and its implications　LIN Yanjuan, LU Lianhuang, CHEN Zhizhe, et al. Fujian Institute of Hematology, Fuzhou　350001

　　【Abstract】　Objective　To investigate the relationship between quantitative change of fibronectin (Fn) or Laminin (Lm) and growth and differentiation of leukemic cells.Methods　The extracellular matrixes, Fn and Lm, in long-term bone marrow culture (LTBMC) from 18 acute myeloid leukemia (AML) patients and 6 normal subjects were examined by immunofluorescence assay. Results　①The Fn or Lm content in 9 AML self-maintained (AMLsm) 1～3 week-cultures was significantly less than that in 9 AML not self-maintained (AMLnsm) cultures. ②In the third week’s cultures, the blasts of 8 AMLnsms decreased to less than 5%, but did not of 7 AMLsms. ③ As the cultures going on, the blasts were related to Fn or Lm contents positively in normal control and negatively in AMLnsm. The blasts were related to Fn contents negatively in AMLsm.Conclusion　The change of Fn or Lm may play an important role in the development of AML. In addition, the difference of Fn or Lm contents between AMLsm and AMLnsm was helpful to the choice of AML patient for in vitro purging of leukemic cells through LTBMC before auto-BMT.

　　【Key words】　Extracellular matrix　　Leukemia, myeloid, acute　　Fibronectin　　Laminin

　　造血干细胞与造血微环境之间相互作用的变化在许多血液病发生、发展中有重要意义。我们应用免疫荧光染色法观察18例急性髓系白血病(AML)患者骨髓细胞长期培养(LTBMC)贴壁层细胞外基质(ECM)的纤连蛋白(Fibronectin, Fn)和基膜连接蛋白(Laminin, Lm)分布及含量的动态变化，以及探讨这类蛋白与白血病细胞生长、分化之间的关系。

　　材料和方法

　　1　病例　初治AML 18例均符合FAB诊断标准。男13例，女5例，中位年龄26(14～55)岁。AML中M₁ 1例，M₂ 5例，M₃ 3例，M₅ 9例。正常对照为健康志愿者6名，中位年龄36(25～52)岁。正常对照及AML标本均取自髂后上棘骨髓。

　　2　LTBMC方法　按Dexter型培养体系略加修改，用Ficoll-Hypaque分离骨髓单个核细胞，培养体系中各种成分的体积分数分别为：80% IMDM、10% 马血清、10%小牛血清，含0.5mmol/L氢化可的松、青链霉素的终浓度分别为0.1mg/ml，细胞终浓度为 2×10⁶/ml。种植于孔径为35mm的6孔培养板(Nunc, Denmark)，每孔3ml，置37℃、体积分数为5%的CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。每周半量换液，计数悬浮细胞数，并离心沉淀(用含体积分数为10%小牛血清的PBS数滴重悬细胞，取1滴于涂有L-多聚赖氨酸的玻片上，推片晾干)，用瑞氏-姬姆萨染色分类。培养7，8周后悬浮细胞增多者，按2×10⁶/ml浓度移种于无基质细胞层的相同培养体系中，能继续传代不断生长者认为是获独立生长(Self-maintained, SM)。

　　3　Fn、Lm染色分级定量法

　　3.1　标本取自培养的第1，2，3，4，6，8周事先置孔底的盖玻片(22mm×22mm)(贴壁层)；用0.01mol/L、pH 7.2的PBS轻轻漂洗2次，每次5分钟，稍干后用丙酮固定5～10分钟。

　　3.2　免疫荧光染色间接法^［1］：一抗均为兔抗人多抗；Lm多抗购自北京医科大学细胞生物室，Fn多抗购自北京中山生物技术公司，二抗为猪抗兔荧光抗体(华美生物工程公司)。

　　3.3　结果判断：在一个高倍视野(6.3×25倍)中依荧光亮度及分布进行分级，无荧光为(-)；少许(一个视野的1/4面积)明亮荧光或少许到小部分(一个视野的1/2面积)清晰荧光为(+)；小部分明亮荧光或大部分(一个视野的3/4面积)清晰荧光为(++)；大部分明亮荧光或全部(整个视野)清晰荧光为(+++)；大部分或全部明亮、闪亮荧光为(++++)。

　　3.4　半定量积分计算法：共对200个荧光显微镜高倍视野(6.3×25倍)分级，平均计算100个视野的积分量(阳性指数)。同时观察Fn、Lm分布及其与造血细胞粘附的动态变化。

　　4　统计学方法　数据以均数形式表达。显著性检验用方差分析、q检验、t检验。

　　 结果

　　1　AML细胞生长特点

　　1.1　悬浮细胞计数结果显示：在培养1～3周，AML 18例和正常对照悬浮细胞分别显著下降至培养前的30%和10%，4～6周维持相对稳定，8周后9例AML悬浮细胞数渐增加，最终获独立生长(AMLsm),另9例AML未获独立生长(AMLnsm)与正常对照均进一步下降不能维持生长。

　　1.2　悬浮细胞分类：发现在培养的前4周，随培养时间的增加，可见AMLsm与AMLnsm的成熟粒、单核-巨噬细胞比例渐升高。幼稚细胞(核大，染色质疏松，有明显核仁)比例渐下降，但从表1可以看到AMLsm于第8周开始幼稚细胞比例又明显升高，除培养前和第4周外，AMLsm各周幼稚细胞比例均显著高于AMLnsm(P＜0.05)。同时发现AMLnsm 9例中8例于第3周时幼稚细胞比例可降至0.05以下，而AMLsm 7例始终未能降至0.05。

表1　正常对照、AMLnsm及AMLsm培养各时相悬浮细胞中幼稚细胞比例变化

　　*与AMLnsm组比，P＜0.052　AML及正常对照的Fn含量及分布的变化

　　2.1　AML及正常对照的Fn含量：见表2，Fn含量均随培养时间的增加渐增加，于2～4周较高，AMLnsm于3～4周较高，均于6周后显著下降(P＜0.05)；AMLsm于4～6周较高，8周后显著下降(P＜0.05)。在培养1～3周，AML的Fn含量显著低于正常对照组(P＜0.05)，AMLsm又显著低于AMLnsm(P＜0.05)；8周时AMLsm显著高于AMLnsm和正常对照组(P＜0.05)。

表2　正常对照、AMLnsm及AMLsm培养各时相细胞外基质Fn含量(半定量)的动态变化

　　*与正常对照组相比，P＜0.052.2　Fn的分布：荧光染色下Fn呈丝条状分布及蜂窝状分布，其间均可见胞膜Fn阳性细胞粘附。正常对照在培养第1周即可见，AMLnsm第2周可见，两者粘附细胞较多，均于6周后消失；而AMLnsm于3～4周才见有细胞粘附，且粘附细胞很少，8周后消失。

　　3　AML及正常对照Lm含量及分布的变化

　　3.1　AML及正常对照的Lm含量：见表3，Lm含量均随培养时间的增加渐增加，正常对照和AMLnsm均于3～4周较高，6周后显著降低(P＜0.05)；AMLsm于4～6周较高，8周后显著降低(P＜0.05)。 AMLsm的Lm含量于1～3周显著低于AMLnsm和正常对照(P＜0.05)，而AMLnsm仅第1周显著低于正常对照(P＜0.05)，4～8周三者无显著差别(P＜0.05)。

表3　正常对照、AMLnsm及AMLsm培养各时相细胞外基质Lm含量(半定量)的动态变化

　　#与正常对照组比较，P＜0.05；*与正常对照及AMLnsm组比较，P均＜0.05

3.2　Lm的分布：荧光染色下Lm可呈现索条状、膜状、斑点状、小灶状分布，见有梭形细胞，胞浆Lm阳性及胞膜Lm阳性细胞粘附。正常对照、AMLnsm、AMLsm出现细胞粘附的时间同Fn，但正常对照粘附的细胞较多，6周后消失；后两者粘附的细胞很少，分别于6及8周后消失。

　　4　AML及正常对照各周的幼稚细胞比例变化分别与各周Fn、Lm含量变化的相关分析　随培养时间的增加，8周前正常对照的幼稚细胞比例变化分别与Fn、Lm含量的变化均呈正相关；4周前AMLnsm则均呈负相关，但AMLsm中只有Fn项呈负相关。在同一时间内幼稚细胞比例与Fn或Lm含量变化无显著相关。

　　 讨论

　　细胞外基质是造血微环境的主要组成部分之一，它不再是过去认为的一种被动、无活力的结构支架，而是造血细胞赖以传递与接受信息的物质基础。许多研究表明，细胞外基质同基质细胞、可溶性生长因子等共同参与造血细胞的增殖、分化、粘附的调控^［2，3］。

　　Fn、Lm均属糖蛋白，是细胞外基质三大类物质(糖蛋白、蛋白多糖和胶原)之一，Fn主要由原始纤维细胞产生；Lm主要由内皮细胞产生。二者均参与造血细胞的粘附，Fn与造血祖细胞的增殖分化有关^［4］，Lm与粒系细胞的分化有关^［5］，它们含量和成分的正常与否同生理造血的调控及病理造血的发生都有密切关系。我们的结果也支持这种观点。也就是随着培养基质细胞的生长，正常对照与AML的Fn、Lm含量渐增加，至3～4周时达最高；6～8周后渐降低，可能与反馈调节及抗原的丢失有关，这也是正常造血细胞在LTBMC中维持较长的造血时间而又不能长久生长的原因之一。悬浮细胞分类发现正常对照的幼稚细胞培养至3～4周稍增多，AMLnsm幼稚细胞明显减少，并有分化成熟的现象，而另一部分的AML幼稚细胞稍有减少，但最终获独立生长。同时还发现在培养的1～3周，AMLsm的幼稚细胞比例显著高于AMLnsm，而Fn、Lm含量却显著低于正常对照和AMLnsm。这与陈琪等^［6］报告急性白血病ECM中Fn含量显著低于正常有类似之处。关于Fn对肿瘤细胞的作用，Saulnier等^［7］认为Fn有两种结构，一种是N端相对分子质量为70000片段的Fn能抑制肿瘤细胞生长；而相对分子质量为85000片段的Fn不能抑制瘤细胞的生长，因此，Fn可能在某些肿瘤中有抑制作用，而在另一些肿瘤中表达上调，并提高对某些生长因子的反应。Basson

　　等^［8］对肿瘤细胞外基质Lm的研究中发现Lm能抑制肿瘤的增殖、扩散，还有促进其分化的作用，表明Fn、Lm含量的变化对肿瘤细胞的生长、分化有一定的影响。我们对AML骨髓细胞进行长期培养，出现AMLsm和AMLnsm两种生长方式，反映了AML细胞生长具有异质性，其机制可能是LTBMC调整部分AML的造血微环境。也为以往认为LTBMC方法能选择性抑制部分白血病患者白血病细胞的体外生长，支持正常造血组织和造血干细胞的体外生存和增殖的作用提供依据。培养初期Fn、Lm的变化是否引起AML细胞生长的不同，对于LTBMC方法应用于AML自身骨髓体外净化的选择可能有参考价值。

　　 参考文献

　　[1]　刘彦仿. 免疫组织化学. 第1版. 北京：人民卫生出版社，1989. 56-68.

　　[2]　Velde-Zimmermann DV, Verdaasdonk MAN, Rademakers LHPM, et al. Fibronectin distribution in human bone marrow stroma: matrix assembly and tumor cell adhesion via α₅β₁ integrin. Exp Cell Res, 1997, 230:111-120.

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　　[4]　Verfaillie CM,McGarthy JB,McGlave PB.Differentiation of primitive human multipotent hematopoietic progenitors into single lineage clongenic progenitors is accompanied by alterations in their interaction with fibronectin. J Exp Med, 1991, 174:693-703.

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　　[6]　陈琪，周淑芸，王时书，等. 急性白血病骨髓细胞外基质的改变. 中华血液学杂志，1995， 16：363-365.

　　[7]　Saulnier R, Bhardwaj B, Klassen J, et al. Fibronectin fibrils and growth factors stimulate anchorage-independent growth of a murine mammary carcinoma. Exp Cell Res, 1996, 222:360-369.

　　[8]　Basson MD, Turowski G, Emenaker NJ. Regulation of human (Caco-2) intestinal epithelial cell differentiation by extracellular matrix proteins. Exp Cell Res, 1996, 225:301-305.

收稿：1997-12-16

　　(校对：张吉贤)