骨髓基质细胞对白血病细胞的直接抑制作用及其机制探讨

中华血液学杂志 1999年第6期第20卷 研究报告

作者：张明徽　陶群　曹雪涛

单位：200433　上海，第二军医大学免疫学教研室

　　我们已经初步证实，功能正常的骨髓基质细胞能将白血病细胞的肿瘤抗原特异地提呈给T淋巴细胞，诱导出特异性抗肿瘤免疫应答(另文报道)，因此，除了造血支持作用以外，功能正常的骨髓基质细胞可能具有免疫监视功能，特别是在清除白血病细胞中至关重要。除了提呈肿瘤抗原、参与特异性抗肿瘤免疫的形成外，骨髓基质细胞对白血病细胞有无直接的抑制作用目前尚不明确。我们通过体内外实验，观察了骨髓基质细胞的直接抑瘤效应及Fas/Fas L系统在此抑瘤效应中的作用。

　　材料和方法

　　1　实验材料　RPMI 1640、DMEM、马血清购自Gibco/BRL;抗小鼠Fas、Fas L单克隆抗体，FITC标记羊抗大鼠、小鼠IgG(H+L)均购自PharMingen公司(San diego,CA)；³H-TdR购自Amersham公司(放射活性537GBq/mmol)。

　　2　实验动物和细胞株　C57BL/6、BALB/c小鼠(6～8周龄，雄性，SPF级)购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。小鼠红白血病细胞株FBL-3(H-2^b)由美国克利夫兰医学中心陈卫博士惠赠。

　　3　骨髓基质细胞的制备　常规处理骨髓细胞，用含rhGM-CSF(15ng/ml)的RPMI 1640完全培养基(体积分数为10%小牛血清、体积分数为10%马血清，2-ME 5×10^-5mol/L，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素)调成1.5×10⁶/ml的细胞悬液，置37℃、体积分数为5% CO₂孵箱中培养3天(12孔板培养，每孔3ml，含细胞4.5×10⁶；24孔板培养，每孔1.5ml，含细胞2.25×10⁶；96孔板培养，每孔300μl，含细胞4.5×10⁵)，洗尽悬浮细胞，贴壁层细胞备用。

　　4　骨髓基质细胞的体外抗原预激　将GM-CSF诱导3天的骨髓基质细胞更换新鲜RPMI 1640培养基(含体积分数为10%小牛血清)继续培养24小时，以抗原肿瘤细胞与骨髓基质细胞比为1∶5的比例加入制备的可溶性肿瘤抗原(抗原量以冻融前的细胞浓度计)置37℃、体积分数为5% CO₂孵箱中培养8小时，洗去抗原及脱落的悬浮细胞并用Rubber Policeman刮取贴壁细胞备用。

　　5　骨髓基质细胞对白血病细胞的体外作用　将经GM-CSF诱导的骨髓基质细胞(96孔板中培养)经不同处理后(FBL-3抗原预激或未经抗原预激)，经⁶⁰Co照射(10Gy)，在原培养板内用RPMI 1640洗2遍，加入用含体积分数为10%小牛血清的RPMI 1640配制的白血病细胞悬液(5×10⁴/ml)200μl/孔，置37℃、体积分数为5% CO₂孵箱中培养72小时。于结束培养前12小时加入³H-TdR(37kBq/孔)，常规收集细胞，计数放射性核素每分钟闪烁计数。

　　6　Fas/Fas L途径阻断实验　将在96孔板中经GM-CSF诱导培养的骨髓基质细胞经⁶⁰Co照射(10Gy)，加入抗Fas L的单抗阻断(0.5μg/孔)，30分钟后，每孔加入白血病细胞200μl(5×10⁴/ml),置37℃、体积分数为5% CO₂孵箱中培养72小时，于结束培养前12小时加入³H-TdR(37kBq/孔)，常规收集细胞，计数放射性核素每分钟闪烁计数。

　　7　荷瘤小鼠模型的制备　取对数生长期的FBL-3白血病细胞用RPMI 1640调成3×10⁷/ml的细胞悬液，取0.1ml于小鼠左腹外侧皮下接种，6天后，肿瘤平均为3.5mm×3.5mm，随机分组接受治疗。

　　8　骨髓基质细胞对荷瘤小鼠的治疗作用　于小鼠荷瘤第6天用骨髓基质细胞进行治疗。将荷瘤小鼠随机分组，每组10只，分组如下：①皮下注射(sc)RPMI 1640对照组；②瘤体内注射(It)RPMI 1640对照组；③皮下注射骨髓基质细胞治疗组；④瘤体内注射骨髓基质细胞治疗组；⑤皮下注射骨髓基质细胞(抗原预激8小时，T/BMSC=1/5)治疗组；⑥瘤体内注射骨髓基质细胞(抗原预激8小时，T/BMSC=1/5)治疗组。

　　将骨髓基质细胞用Rubber Policeman刮取，再配成2×10⁷/ml的细胞悬液，瘤体内治疗组每鼠瘤体内注射细胞悬液0.1ml，皮下治疗组每鼠左股内侧皮下注射细胞悬液0.1ml，对照组每鼠相应注射无血清RPMI 1640 0.1ml。治疗后48小时各组中随机取两只小鼠取完整肿瘤组织作病理分析，剩余小鼠每2天测量肿瘤大小。

　　9　统计学处理　采用未配对计量资料的t检验。

　　结果

　　1　抗原预激的GM-CSF诱导的骨髓基质细胞对白血病细胞的体外抑制作用及Fas L阻断对抑制作用的影响　FACS的检测结果显示，FBL-3表达较高水平的Fas蛋白(65%)；经肿瘤抗原刺激的骨髓基质细胞表达高水平的Fas L分子(91%)。图1所示，经GM-CSF诱导成熟的骨髓基质细胞对FBL-3有一定的抑制作用，抑制率为32%；而经抗原预激后的骨髓基质细胞对FBL-3细胞的抑制率高达79%。作用体系中加入抗Fas L的单抗后几乎可以完全阻断骨髓基质细胞对FBL-3的抑制作用(抑制率降为3%)。抗Fas L单抗阻断实验充分说明了骨髓基质细胞对FBL-3的生长抑制作用是由Fas/Fas L系统介导的；FBL-3细胞上表达高水平的Fas蛋白，抗原预激的骨髓基质细胞上表达高水平的Fas L分子是其相互作用的分子基础。

　　1：预激的骨髓基质细胞+FBL-3+Ab; 2:预激的骨髓基质细胞+FBL-3; 3:骨髓基质细胞+FBL-3

　　图1　Fas/Fas L系统在抗原预激的GM-CSF诱导的骨髓基质细胞抑制白血病细胞增殖中的作用

　　2　骨髓基质细胞治疗后肿瘤局部的病理学变化　经抗原预激的骨髓基质细胞瘤体内治疗组肿瘤组织广泛坏死，波及肿瘤边缘，坏死肿瘤组织中仍可见残留的炎性浸润细胞；未经抗原预激的骨髓基质细胞瘤体内治疗组也出现肿瘤组织较为广泛的坏死，坏死区可见大量的炎性细胞浸润，但坏死程度较抗原预激骨髓基质细胞瘤体内治疗组轻；抗原预激的骨髓基质细胞皮下治疗组肿瘤组织生长旺盛，瘤体中央可见自然坏死灶，坏死区边缘少见浸润细胞；对照组肿瘤组织生长旺盛，少见坏死灶。

　　3　骨髓基质细胞治疗对白血病细胞生长的影响　从白血病小鼠模型的瘤体大小测量来看(图2)，抗原预激的骨髓基质细胞瘤内治疗组效果明显好于其它各组，预激的骨髓基质细胞皮下注射治疗组次之，未经抗原刺激的骨髓基质细胞瘤体内治疗组也有较好疗效，在治疗后第9天，基质细胞瘤体内注射组与培养液瘤体内注射对照组比较瘤体大小差异显著(P＜0.01)；而未经抗原刺激的骨髓基质细胞皮下治疗组与对照组比较差异不显著。治疗后21天，抗原预激的基质细胞瘤体内注射组与皮下注射组均有3/5的小鼠肿瘤消失，未经抗原预激的基质细胞瘤体内注射组有2/5的小鼠肿瘤消失；其它各组中均无肿瘤完全消退者。

2　骨髓基质细胞治疗后的肿瘤生长曲线

　　讨论

　　异常的造血微环境可以诱发白血病，而发生的白血病也可能对骨髓基质细胞产生一定的影响，妨碍其正常功能的发挥。功能正常的骨髓基质细胞对白血病细胞的生物学特性有何影响、有无直接抗肿瘤作用，目前尚无定论。

　　体外贴壁获得的骨髓基质细胞虽然在成分和功能上都不能完全模拟体内造血环境，但仍是一个研究造血微环境的良好的体外模型。体外分离获得的小鼠骨髓基质细胞是一个以单核-巨噬细胞为主的细胞群体。TNF-α和一氧化氮(NO)是巨噬细胞发挥杀伤作用的两种主要效应因子，经肿瘤抗原刺激的骨髓基质细胞分泌较高水平的TNF-α，但NO的产生水平却不高(另文报道)。以往的研究发现几乎所有的外周血巨噬细胞(包括腹腔巨噬细胞、肝脏枯否氏细胞、肺泡巨噬细胞等)活化后NO产生水平均有升高。虽然体外分离的小鼠骨髓基质细胞中F4/80阳性的巨噬细胞达90%，但活化前后NO的产生水平并无明显升高，因此，可以推测骨髓基质型的巨噬细胞在功能上可能有别于其它组织的巨噬细胞。经肿瘤抗原刺激后分泌的TNF-α可能是骨髓基质细胞抑制白血病细胞生长的重要因素之一。

　　经肿瘤抗原刺激后的骨髓基质细胞还表达高水平的Fas L，Fas/Fas L是CTL发挥杀伤作用的一个重要机制^［1］，通过Fas蛋白传入凋亡信号使靶细胞发生凋亡。骨髓基质细胞经抗原刺激后高表达Fas L，骨髓基质细胞能否借助Fas/Fas L系统杀伤肿瘤细胞呢体外增殖抑制实验的结果提示，抗原刺激的骨髓基质细胞对FBL-3白血病细胞有明显的生长抑制作用；用抗Fas L单抗进行的阻断实验显示，抗Fas L单抗几乎可以完全阻断对FBL-3的抑制作用，这提示骨髓基质细胞对FBL-3肿瘤细胞的抑制作用很大程度上是由Fas/Fas L系统介导的。

　　体内实验的结果提示，骨髓基质细胞对FBL-3白血病小鼠具有良好的治疗作用。抗原预激的BMSC皮下注射也有较好的治疗效果，但小鼠的带瘤时间较瘤体内治疗组明显延长，我们已有实验证实抗原预激的骨髓基质细胞在体内能诱导出特异性免疫功能(另文报道)，这也是抗原刺激的骨髓基质细胞的体内抗瘤机制之一；抗原预激的骨髓基质细胞瘤体内注射对肿瘤有较好的治疗作用提示，快速的杀瘤作用是由基质细胞的直接效应引起的。因此，骨髓基质细胞的体内抗瘤作用可能归于两方面的因素：①预激的骨髓基质细胞在体内诱导出特异性抗瘤免疫功能；②抗原预激的骨髓基质细胞的直接抗瘤作用。抗原预激的骨髓基质细胞瘤体内治疗的杀伤以直接效应为主。因此可以推断，抗原预激的骨髓基质细胞在体内可以通过直接杀伤效应和间接诱导产生特异性免疫应答来发挥抑瘤作用。

　　本实验证实了骨髓基质细胞对白血病细胞具有直接抑制效应，Fas/FasL系统在其中发挥了重要作用，这为研究骨髓造血微环境与白血病的关系及白血病的生物治疗提供了新的实验思路。

　　本课题受国家自然科学基金(39730420)资助

　　参考文献

　　［1］　Atkinson EA, Bleackley RC. Mechanisms of lysis by cytotoxic T cells. Crit Rev Immunol, 1995, 15:359-384.

收稿：1997-11-07

　　修回：1998-07-06