小儿急性淋巴细胞白血病p16和p15基因缺失与转录异常的研究

中华血液学杂志 1999年第7期第20卷 论著

作者：付国　吕昌龙　张瑞英　胡宛如　翟玲　胡品良

单位：付国　吕昌龙　翟玲　胡品良　110001沈阳，中国医科大学免疫学教研室；张瑞英　胡宛如　中国医科大学附属第一临床学院

　　关键词： 白血病；淋巴细胞性；急性基因；p16基因；p15

　　摘要　目的了解p16(MTS1)和p15(MTS2)基因异常与小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)发生的关系。方法用聚合酶链反应(PCR)和Southern blot杂交法检测了21例小儿ALL患者骨髓细胞p16和p15基因的缺失情况；用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了19例患儿p15mRNA表达。结果经PCR检测，p16基因外显子1，2均缺失者8例(38.1％)，p15基因外显子1，2均缺失者为11例(52.3％)。Southern blot检测的结果与PCR的结果相一致。RT-PCR检测发现2例p15基因不缺失患儿的样品无p15mRNA表达。结论p16和p15基因在ALL患儿中存在高频率缺失和转录异常，提示这两种基因在ALL患儿的淋巴细胞恶性转化中起重要作用。

Deletions and aberrant transcription of p16 and p15 genes in childhood acute lymphoblastic leukemia

FU Guo　LU Changlong　ZHANG Ruiying　et al.

　　Department of Immunology, China Medical University, Shenyang 110001

　　Abstract Objective To explore the role of p16(MTS1) and p15(MTS2) genes in the pathogenesis of childhood acute lymphoblastic leukemia(ALL). Methods PCR and Southern blot were used to analyse p16 and p15 gene deletions,RT-PCR was used to analyse p15 gene transcription. Results Exon l and 2 of p16 gene deletion was detected in 8 of 21 patients(38.1％), and exon l and 2 of p15 gene deletion in 11 of 21 patients(52.3％). Aberrant p15 gene transcription was observed in two cases. Conclusion High frequency of p16 and p15 gene deletions and aberrant transcription may be involved in the pathogenesis of childhood ALL.

　　Key words Leukemia,lymphoblastic,acute Gene,p16 Gene,p15

　　1994年Kamb等^[1]报道p16(MTS1)和p15(MTS2)基因在多种人类肿瘤中存在缺失或突变，其编码产物参与细胞增殖的负调节。我们应用聚合酶链反应(PCR)、Southern blot(印迹)杂交和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对p16和p15基因在小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中的缺失及p15基因的转录进行了检测，以了解p16和p15基因异常与小儿ALL的关系。

　　病例和方法

　　1　研究对象　小儿ALL患者21例，其中男13例，女8例，年龄4个月～14岁，均经FAB分型确诊。取材前患者未经任何治疗，无菌采取骨髓，－70℃保存备用。

　　2　DNA和RNA的提取　按照常规的酚-氯仿法从骨髓样品中提取DNA。用异硫氰酸胍一步法提取总RNA^[2]，经不含RNA酶的DNA酶消化后，置于－70℃备用。

　　3　PCR扩增　以上述提取的样品DNA为模板，应用PTC-200扩增仪（MJ公司）扩增p16外显子1，2和p15外显子1，2基因片段。所用引物(由澳大利亚Kees博士馈赠)的序列为：p16外显子1引物:5'-GAAGAAAGAGGAGGGGCTG-3'(上游),5'-GCGCTACCTGATTCCAATTC-3'(下游);p16外显子2引物:5'-GGAAATTGGAAACTGGAAGC-3'(上游),5'-TCTGAGCTTTGGAAGCTCT-3'(下游);p15外显子1引物:5'-CCAGAAGCAATCCAGGCGCG-3'(上游),5'-AATGCACACCTCGCCAACG-3'(下游);p15外显子2引物:5'-CCTTAAATGGCTCCACCTGC-3'(上游),5'-CGTTGGCAGCCTTCATCG-3'(下游)。以β-globin为内参照。

　　扩增条件为95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行45个循环，扩增体系总量为25μl。扩增产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色观察。

　　4　探针制备　用于制备探针的DNA片段为p16外显子1和p15外显子2的PCR扩增产物。按照O’Reilly等的方法^[3]分离纯化扩增的DNA片段，然后应用常规随机引物法标记放射性核素，制备探针。所用放射性核素为α-32PdATP。

　　5　Southern blot　取5μg样品DNA用EcoRⅠ限制性内切酶酶切后，经20g/L琼脂糖凝胶电泳分离并转印至Hybond＋尼龙膜，与上述制备的探针杂交过夜，洗去未结合的放射性核素，X线胶片曝光后，用密度扫描仪进行检测。

　　6　RT-PCR　取上述提取的RNA，采用AMV逆转录DNA聚合酶（Promega产品）逆转录合成cDNA,再按上述方法扩增p15基因片段，所用引物为p15外显子1上游引物和p15外显子2下游引物。

　　结果

　　1　PCR法扩增p16和p15基因　应用PCR法对21例小儿ALL患者骨髓细胞中p16基因外显子1，2和p15基因外显子1，2的扩增结果显示，p16外显子1扩增产物长340bp，有10例缺失，缺失率47.6％;p16外显子2扩增产物长509bp,有9例缺失，缺失率42.8％;外显子1，2共同缺失8例，缺失率38.1％。p15外显子1扩增产物长532bp,有12例缺失，缺失率57.1％;p15外显子2扩增产物长427bp,有11例缺失，缺失率52.3％;外显子1，2共同缺失11例，缺失率52.3％。p16和p15基因4个外显子共同缺失6例，缺失率28.6％。

　　2　Southern blot法检测p16和p15基因　21例患者DNA样品经EcoRⅠ酶切、电泳分离后与标记探针分别杂交，结果显示p16基因缺失10例，p15基因缺失11例。这一检测结果与相应的PCR法检测的结果一致。图1为Southern blot方法检测p16基因缺失的结果。

　　15，16，18，20，22号样品显示p16基因存在；19，21号样品显示p16基因缺失

　　图1　Southern blot检测p16基因缺失

　　3　RT-PCR检测p15mRNA的表达　应用RT-PCR法检测19例患者DNA样品的p15mRNA的表达，其中17例与PCR和Southern blot检测的结果相吻合，另2例经PCR和Southern blot检测证明p15基因阳性，但p15mRNA表达为阴性(图2）。

　　3，7，9号mRNA表达阴性；4，6，10号mRNA表达阳性

　　图2　RT-PCR检测p15mRNA表达

　　讨论

　　自1994年Kamb等^[1]报道p16和p15基因与多种类型肿瘤有关以来，已有一些学者相继报道了他们检测的白血病患者临床样品及培养细胞株中p16和p15基因异常的结果。Herbert等^[4]和Cayuela等^[5]应用Southern blot方法分析了77例ALL患者白细胞的p16和p15基因缺失情况，p16基因缺失率为45.5％,p15基因的缺失率为36.7％。Okuda等^[6]调查了43例小儿ALL患者，有23例显示p16和p15基因缺失，缺失率53.5％。在本研究中，我们应用PCR扩增和Southern blot方法检测了21例小儿ALL患者骨髓细胞的p16和p15基因缺失。结果显示，p16基因的缺失率为47.6％，p15基因的缺失率为52.3％,这表明p16和p15基因在小儿ALL中有较高频率的缺失。造成缺失的具体机制目前尚不清楚。另外，许多研究者所报道的ALL中p16和p15基因的缺失率差别较大，这可能是由于选取的标本中包含的T细胞性ALL(T-ALL)和B细胞性ALL(B-ALL)比例不同所致，多数研究者认为T-ALL中的p16和p15基因的缺失率显著高于B-ALL中这两个基因的缺失率^[6]。

　　多数报道认为p16基因较p15基因更易于缺失，但也有与之相反的报道^[7]。在我们的研究中，p15基因的缺失率略高于p16基因的缺失率，这提示p16和p15基因缺失在不同类型肿瘤发生中可能起着不同的作用。另外，在我们应用PCR检测所获得的结果中，还发现p16基因外显子1，2及p15基因外显子1，2并不是同时连锁缺失。这些结果均表明了p16和p15基因缺失的复杂性。此两种基因不同程度的缺失造成表达异常，很可能在小儿ALL等一些恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用。

　　在本研究中，我们应用RT-PCR方法检测了19例患儿p15mRNA的表达，17例检测结果与PCR和Southern blot检测结果相符合，但有2例虽被证实有p15基因存在，却未检测出其mRNA表达。这说明p15基因在转录水平上有时也存在异常。我们知道DNA甲基化是影响基因正常表达的重要因素之一，已有学者在对小儿ALL的研究中发现p15基因，特别是其中CpG岛序列部分易发生甲基化^[8]，而CpG岛非甲基化是与其相关联基因表达的必要条件。因此，我们检出的这2例p15基因mRNA表达异常不能排除该基因已被甲基化的可能性。

　　综上所述，p16和p15基因不同程度的缺失及在转录、表达等不同水平上的异常可能与小儿ALL的发生密切相关。因此，有必要深入探讨p16和p15基因在小儿ALL出现异常的原因和机制，为小儿ALL转基因治疗提供依据。

　　参考文献：

　　1　Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994, 264:436-440.

　　2　Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem,1987,162:156-159.

　　3　O’ Reilly J, Meyer B, Baker D, et al. Correlation of bone marrow minimal residual disease and apparent isolated extramedullary relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia ， 1995,15:624-627.

　　4　Herbert J,Cayuela JM,Berkeley J,et al.Candidate tumor-suppressor genes MTS1(p16INK4A) and MTS2(p15INK4B) display frequent homozygous deletion in primary cells from T-but not from B-cell lineage acute lymphoblastic leukemias. Blood,1994,84:4038-4044.

　　5　Cayuela JM,Herbert J,Sigaux F.Homozygous MTS1(p16INK4A) deletion in primary tumor cells of 163 leukemia patients. Blood,1994,85:854.

　　6　Okuda T, Shurtleff SA,Valentine MB, et al.Frequent deletion of (p16INK4A)/MTS1 and (p15INK4B)/MTS2 in pediatric acute lymphoblastic leukemia.Blood,1995,85:2321-2330.

　　7　Stone S,Dayananth P,Jiang P,et al. Genomic structure, expression and mutational analysis of the p15(MTS2) gene. Oncogene,1995,11:987-991.

　　8　Batova A, Diccianni MB, Yu JC, et al. Frequent and selective methylation of p15 and deletion of both p15 and p16 in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res, 1997, 57:832-836.

收稿：1998-03-20修回：1999-02-25

校对：张志方