HLA相合同胞脐血移植治疗急性髓系白血病成功——国内首例报告
中华血液学杂志 1999年第8期第20卷 论著
作者：宋永平 王桂菊 万鼎铭 王桂叶 刘长凤 乔玉环 盛光耀 邹典斌
单位：郑州，河南医科大学第一附属医院 450052
关键词： 造血干细胞移植，脐血；白血病，粒细胞，急性
【摘要】目的 研究脐血移植(UCBT)对恶性血液病的根治性治疗；观察其长期造血重建和移植物抗宿主病(GVHD)及移植并发症发生情况。方法 给1例急性粒细胞白血病完全缓解期的11岁男性患儿移植HLA配型相合的同胞脐血。预处理选用BU/CY方案(马利兰4mg．kg－1．d－1×4，环磷酰胺60mg．kg－1．d－1×2)。GVHD预防用环孢霉素A(CsA)。移植有核细胞为0.35×108/kg，CFU－GM1.82×104/kg，CD34＋细胞2.04×105/kg。结果 ＋14天骨髓显示造血重建；＋21天中性粒细胞(ANC)＞1.0×109/L；＋60天DNA位点检测显示移植物植入成功；＋100天受者血型由O型转为供者血型B型。随访330天，患者情况正常，未发生急、慢性GVHD。结论 本例为国内首例异基因脐血移植治疗急性粒细胞白血病获得成功；开展同胞HLA相合脐血移植安全、有效，适合中国国情，值得深入研究。
Successful treatment of AML by HLA－compatible sibling umbilical cord blood stem cell transplantation——The first case report in China
SONG Yongping，WANG Guiju，WAN Dingming，et al.First Affiliated Hospital,Henan Medical University, Zhengzhou 450052
【Abstract】Objective To apply umbilical cord blood stem cell transplantation (UCBSCT) to the treatment of hematological malignancies, and to observe the persistent hematopoietic reconstitution, graft－versus－host disease (GVHD) and transplantation－related complications.Methods An 11－year－old patient with acute myeloid leukemia in complete remission (CR) received UCBSCT from a HLA－compatible sibling. The conditioning regimen was BU/CY (busulfan 4 mg．kg－1．d－1× 4,cyclophosphamide 60 mg． kg－1． d－1× 2). CsA was given for prophylaxis of acute GVHD. The patient received 0.35× 108 nucleated cells/kg, including 1.82× 104 CFU GM/kg and 2.04× 105 CD34＋ cells/kg.Results The recipient showed hematopoietic reconstitution on day 14 post－transplantation;ANC＞1.0× 109/L on day 21; DNA fingerprinting showed engraftment on day 60, the blood type of the patient changed from O group to B group. In the follow－up of 330 days, the patient was in good condition without acute or chronic GVHD.Conclusion It is the first case reported in China that have succeeded in the treatment of acute myeloid leukemia by allogeneic UCBSCT.
【Key words】 Stem cell transplantation,umbilical cord blood Leukemia, myeloid,acute
脐血含有丰富的造血干细胞，且具有来源广泛、采集方便、移植物抗宿主反应(GVHR)轻和巨细胞病毒检出率低等优点。1988年Gluckman等[1]首次对1例范可尼贫血男孩进行脐血移植(UCBT)获得成功以来，UCBT在临床上迅速推广，目前已成为异基因骨髓移植(allo－BMT)的一种有效替代手段[2]。1998年4月我们首次应用HLA相合同胞UCBT治疗急性粒细胞白血病(AML)1例，报告如下。
病例和方法
1 病例 患儿，男，11岁。1997年2月12日因发热、咽痛伴进行性苍白、乏力10天而入院，经血和骨髓检查确诊为AML－M2a。住院后经DA方案(柔红霉素和阿糖胞苷)化疗1疗程后骨髓中原始粒细胞＋早幼粒细胞降至0.08。因发热、头痛行腰穿检查脑脊液，确诊合并脑膜白血病，给予鞘内注射化疗药物及60Co头颅照射20Gy，相继用DA及HAD方案（高三尖杉酯碱、阿糖胞苷和柔红霉素)化疗各1疗程，2个月后达完全缓解(CR)。以后交替用HA、DA及中剂量阿糖胞苷(MD－Ara－C,1.0g/12h×3)强化治疗9个疗程。在第6个疗程用MD－AraC加粒细胞集落刺激因子(G－CSF，Kirin公司产品)动员自身外周血干细胞，经血细胞分离机采集后冻存于－80℃冰箱中备用。UCBT前查体:身高147cm，体重37kg，浅表淋巴结不肿大，心、肺正常，肝、脾不大；外周血、骨髓及脑脊液检查均示CR；肝、肾功能无异常，肝炎病毒全套检查均阴性，咽拭子、血、尿、粪细菌培养均阴性；血巨细胞病毒包涵体IgG(＋),IgM(－);B超检查肝、胆、胰、脾、肾和X线胸片均示正常。
2 供者 系患儿胞弟。母亲再孕一男婴，并于产前(孕30周)行脐静脉取血作HLA配型，结果：A、B、DR、DP、DQ位点与患儿完全相合；混合淋巴细胞培养(MLC)阴性；红细胞血型不合(供者B型，受者O型)；抽羊水查细胞核型正常。
3 移植过程
3.1 预处理方案：采用BU/CY方案：马利兰(BU)1mg/kg，每6小时1次，共16次(－8～－5天)；环磷酰胺(CY)60mg．kg－1．d－1(－4～－3天)。
3.2 产后脐血采集：于母亲预产期前9天常规剖腹产，采用1次性无菌采血袋采血法采集脐带血250ml(含ACD－B保养液70ml)，有核细胞计数6.2×109/L，其中淋巴细胞占0.48。采集胎盘血20ml，验证红细胞血型，测定T细胞亚群，并行病原学检查：血培养细菌和真菌均阴性，聚合酶链反应（PCR）检测乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒和疱疹病毒均阴性。
3.3 去除红细胞及移植：所采集脐血用5g/L甲基纤维素分离去除红细胞后，通过静脉输注给患儿。有核细胞回收率84％，移植有核细胞0.35×108/kg，CFU－GM1.82×104/kg，CD34＋细胞2.04×105/kg。
4 GVHD预防 环孢霉素A(CsA)3.4mgＣkg－1．d－1，持续24小时静滴(－1～＋21天)，此后口服10.8mg．kg－1．d－1，维持至＋50天，逐渐减量，＋150天停用。定期检测全血CsA浓度，＋100天之内，CsA维持在200～350μg/L。
5 支持治疗
5.1 细胞因子的应用：rhGCSF皮下注射300μg/d，＋5～＋22天；150μg/d，＋23～＋26天；75μg/d，＋27～＋30天。重组人红细胞生成素(rhEpo,Kirin公司产品)，每次1500U，＋7～＋28天，每周2次，＋29～＋56天，每周1次，皮下注射。
5.2 成分血输注：分别于＋8、＋11、＋14、＋17和＋21天输单采血小板3×1011(O型血)，于＋32天输O型少浆血400ml。血制品输注前均经60Co25Gy照射。
5.3感染的预防：－10～＋31天行全环境保护，交替应用抗生素(青霉素、西力欣、泰能和美福仙)；白细胞降至零时，给予丙种球蛋白2.5g/d，＋5～＋28天。
5.4 BU/CY不良反应的预防：在服BU同时，口服苯妥英钠50mg，1日3次，预防惊厥的发生；水化、碱化尿液，强迫利尿及用Mesna预防CY引起的出血性膀胱炎；加强保肝，并静滴复方丹参注射液20ml/d，－10～＋21天，预防肝静脉闭塞病(VOD)。
6 DNA位点测定 用Chelex法提取DNA，经过Geneprintpowerplex1.2系统扩增，产物用ABIPRISM377测序仪检测。
结果
1 移植后血象变化 ＋4天受者WBC降至0，持续7天；＋21天WBC＞1.0×109/L，ANC＞0.5×109/L；＋28天WBC＞2.0×109/L，ANC＞1.0×109/L，BPC＞20×109/L；＋42天BPC＞50×109/L；＋56天WBC＞4.0×109/L，ANC＞2.0×109/L；＋100天Hb102g/L,WBC6.1×109/L，BPC153×109/L，Ret0.028；＋330天Hb124g/L，WBC8.3×109/L，BPC215×109/L。
2 骨髓象 0天骨髓增生减低，原始细胞及幼稚细胞几乎见不到；＋14天骨髓增生活跃，粒系及红系各为0.235及0.325，全片巨核细胞5个；＋60天骨髓增生明显活跃，粒系及红系各为0.290及0.230，原始粒细胞＋早幼粒细胞为0.034，全片巨核细胞121个；＋330天骨髓涂片检查正常。
3 红细胞血型变化 孕妇产前及产后2次检查脐血红细胞血型为B、CCDee、N型。UCBT后受者血型逐渐变成供者血型，见表1。
表1 患儿行UCBT不同时间血型变化
| 时间（天） |
ABO |
Rh |
MN |
| －10 |
O |
CCDee |
M |
| ＋30 |
O |
CCDee |
M |
| ＋60 |
B |
CCDee |
MN |
| ＋100 |
B |
CCDee |
N |
| ＋330 |
B |
CCDee |
N |
4 DNA位点分析 移植前受者与供者脐血TH01、CSF1PO位点基因型不同，TPOX位点相同；＋60天上述3个位点基因型与脐血相同，见图1。
a:标准梯度；b:DNA位点；c:受者移植前；d:脐血；e:受者移植后
1脐血移植后DNA位点基因型的转变
讨论
1 同胞UCBT和产前HLA配型的优 越性要进行UCBT，必须寻找HLA相合的脐血干细胞供者。因建立脐血库受经济及技术条件的限制，开展非血缘UCBT在我国尚有一定难度。我们根据同胞间HLA相合机率达25％～30％，从诱导缓解成功的急性白血病患儿入手，首先让其母亲再次怀孕，然后于孕25～30周抽取脐血作HLA配型。若相合，对准备接受UCBT的患儿可提前进行系统的治疗并选择合适的移植时间。另外，非冻存的UCBT避免了分离单个核细胞和冷冻造成的干细胞丢失，对于高体重(＞30kg)患儿尤为适用。
2 造血功能重建 造血功能在＋4～＋11天达到极度抑制；＋21天WBC＞1.0×109/L，ANC＞0.5×109/L；＋28天BPC＞20×109/L；＋42天BPC＞50×109/L。随访患者，骨髓造血功能逐渐恢复，外周血象稳定，＋60天DNA位点检测证实完全植入，＋100天红细胞血型完全转为供者型，＋330天外周血象及骨髓检查正常，说明造血功能已持久重建，UCBT成功。
UCBT至少要输入多少有核细胞，移植后应用造血生长因子是否促进造血恢复，目前意见尚不一致。Wagner等[3]根据44例UCBT的结果，初步认为造血恢复时间与输入有核细胞数的多少无明显关系，造血生长因子对UCBT后造血恢复没有明显促进作用；但欧洲骨髓移植组(EBMT)提出，有核细胞＜1×107/kg或CD34＋细胞＜2×105/kg时不宜移植；本例患儿输入有核细胞数较多(0.35×108/kg)，CD34＋细胞＞2×105/kg,加之rhG－CSF和rhEpo应用早、剂量大、时间长，故WBC、ANC和BPC恢复时间令人满意。要确定UCBT输入有核细胞的阈值及证明造血生长因子是否促进造血，还有待积累更多的病例并随机分组研究得出结论。
3 GVHD和感染 脐血中淋巴系统抗原表达弱、淋巴细胞功能不成熟,因此，GVHD发生率低且轻。本供、受体HLA完全相合，预防性应用CsA，且UCBT后一直未合并感染，故未发生急、慢性GVHD。患者UCBT后接近1年，仍处于CR，远期白血病是否复发有待进一步观察。
UCBT所用的预处理对免疫系统有广泛的破坏，依赖植入的脐血干细胞重建免疫的过程相当缓慢，极易发生严重感染。因此，UCBT后加强支持治疗至关重要。在白细胞“零”期应用广谱、高效抗生素预防感染必不可少，早期应用静脉丙种球蛋白及造血生长因子可促进免疫功能恢复，减少感染发生。
4 BU/CY预处理对儿童的安全性 因TBI对儿童生长发育有一定影响，本例患儿又进行过60Co头颅照射，故选用BU/CY方案。该方案抗白血病作用和免疫抑制作用确实可靠，但出血性膀胱炎和HVOD发生率略高于TBI/CY方案。本例加强相应的预防措施，未发生任何并发症。结果表明，BU/CY方案对儿童白血病患者安全、有效，预处理期间定期排尿是预防小儿出血性膀胱炎的关键。
志谢：感谢中国医学科学院血液学研究所严文伟教授、山东医科大学附属医院沈柏均教授和付庆诏教授的大力支持；感谢公安部物证鉴定中心李万水同志对DNA位点的测定和分析
参考文献
1 Gluckman E, Broxmeyer HE, Auerbach AD, et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical cord blood from a HLA－identical sibling. N Engl J Med, 1989, 321:1174－1178.
2 Kelly P, Kurtzberg J, Vichinsky E, et al. Umbilical cord blood stem cells: application for the treatment of patients with hemoglobinopathies. J Pediatr, 1997, 5:695－702.
3 Wagner JE, Kernan NA, Steinbuch M, et al. Allogeneic sibling umbilical cord blood transplantation in children with malignant and non malignant disease. Lancet, 1995, 346:214－219.
(收稿：1999－04－01)
(校对：王叶青)
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