慢性粒细胞白血病树突状细胞对特异性抗白血病T细胞的作用

中华血液学杂志 1999年第9期第20卷 研究报告

作者：郭宝强　金光香　孙汭　田志刚　李公宝　马传香　许福亮　纪恩美　徐功立

单位：郭宝强　266011　青岛大学医学院附属青岛市立医院血液学研究室；金光香、李公宝、马传香、许福亮、纪恩美　潍坊医学院附属医院血液学研究室；孙汭、田志刚；山东医学科学院山东肿瘤生物治疗研究中心；徐功立　山东省立医院血液科

　　树突状细胞(DC)是有效的抗原呈递细胞，我们从初诊慢性粒细胞白血病慢性期(CML-CP)患者的外周血中培养出DC，探讨其对特异性抗白血病T细胞(Anti-LB-T)的作用。

　　病例和方法

　　1　病例

　　初诊CML-CP患者16例。均有t(9；22)染色体异常。其中男10例，女6例。年龄32（18～45）岁。分别将与其中6例患者HLA相合的6名健康亲属作为正常对照。

　　2　单个核细胞(MNC)的分离制备

　　取肝素抗凝的外周血或骨髓2～3ml，按文献［1］分离外周血单个核细胞(PBMNC)或骨髓单个核细胞(BMMNC)，用RPMI 1640培养液离心洗涤3次。CML-CP患者的PBMNC用于外周血DC和T细胞的培养。而CML-CP患者及正常对照的BMMNC冻存后用作靶细胞，进行杀伤试验。

　　3　CML-CP患者外周血中DC的培养

　　取洗涤的PBMNC，用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2×10⁶/ml,以25cm²的培养瓶，在体积分数为5%的CO₂孵箱中培养。RPMI 1640完全培养液中含有2mmol/L谷氨酰胺，体积分数为10%的灭活胎牛血清(FCS), 青霉素100U/ml, 链霉素100U/ml, 羟乙基哌嗪乙烷磺酸(HEPES) 20mmol/L, GM-CSF 1000U/ml(美国先灵葆雅公司产品)，TNF-α 50U/ml， IL-4 1000U/ml(Genzyme公司产品)。每3～4天进行换液，同时计数细胞并取少量细胞进行离心涂片，作形态观察和免疫表型分析，于第14天对培养的DC进行R显带染色体分析。

　　4　CML-CP患者外周血T细胞的培养及在DC存在下进行扩增

　　将分离的CML-CP患者的PBMNC用含有体积分数为10% FCS和1000U/ml IFN-α(美国先灵葆雅公司产品)的RPMI 1640培养液悬浮细胞，并调整细胞浓度为1× 10⁶/ml，放入体积分数为5%的CO₂孵箱中培养24小时，离心并用RPMI 1640洗涤，用含有5μg/ml刀豆素A(ConA，Sigma)和1000U/ml IL-2(军事医学科学院产品)的培养基重新悬浮，继续培养。收集不粘附的细胞，每3～4天用含有IL-2的RPMI 1640培养液进行换液。培养7天后将以上细胞分成两组：一组加入经放射线(30Gy⁶⁰Co)处理的DC，比例为3∶1；另一组仅加入含有IL-2的RPMI 1640培养液。两组细胞均在含有IL-2的RPMI 1640培养液中再培养7天，每3天换液1次，然后进行免疫表型分析和细胞毒实验。

　　5　免疫表型分析

　　采用本室建立的APAAP法^［2］。一抗CD₂、CD₄、CD₈和CD₁₆购自军事医学科学院邦定公司；CD_1a和CD₁₃为PharMingen公司产品。

　　6　细胞毒实验

　　采用LDH释放法^［3］。以K562细胞和液氮冻存复苏的CML患者的自体白血病细胞作靶细胞。以不同的效靶比例进行细胞毒实验。

　　7　R显带染色体分析

　　参照文献［4］进行。

　　结果

　　1　CML-CP患者外周血DC培养过程中的形态及增殖情况观察

　　刚分离的CML-CP患者PBMNC呈球形呈散在分布，表面光滑；培养2天时细胞数减少，部分细胞死亡；存活细胞经3～4天培养后，胞体增大，细胞表面有短的突起，并呈葡萄状聚集，但不与瓶壁粘附；培养1周后大多数细胞成簇聚集，少量细胞呈分散状态，未粘附细胞胞体较大并有长的突起，另外也能见到少量粘附的巨噬细胞。培养不同时间细胞增殖情况见图1。DC所占比例逐渐增大，培养第2天DC不足1%，培养第1，2周分别增加到(24.1±6.0)%和(53.3±14.8)%。

图1 CML-CP患者DC细胞培养中细胞增殖情况

　　2　免疫表型及遗传学分析结果

　　培养14天DC R显带染色体分析具有t(9；22)染色体异常，70%～80% DC表达CD_1a，而刚分离的CML-CP患者的PBMNC CD_1a⁺细胞小于1%。IL-2加DC共同培养T细胞，培养第 2周时CD₈⁺细胞为(64.2±20.1)%，CD₄⁺细胞为(32.1±15.4)%, CD₁₆⁺细胞为(3.2±1.6)%，CD₂⁺细胞大于95%，而CD₁₃⁺细胞不到1%，与单用IL-2刺激的T细胞相比，差异无显著性(P＞0.05)。

　　3　IL-2加DC共同培养的T细胞对自体白血病细胞的杀伤活性［(80.2±12.6)%］比单用IL-2培养的T细胞的杀伤活性［(16.3±8.1)%］明显增强(P＜0.01)(效靶比为25∶1)，3种效靶比下二者的比较详见表1。

表1　CML-CP患者DC加IL-2及IL-2单独诱导的T细胞对自体CML细胞的杀伤活性比较

　　4　6例CML-CP患者DC刺激的T细胞对K562细胞及HLA相合的健康人BMMNC杀伤作用［分别为(12.3±5.9)%和(10.2±6.2)%］，与对自体白血病细胞的杀伤活性相比［(81.6±12.1)%］明显减低(P＜0.01)(表2)。

　表2　CML-CP患者DC刺激的T细胞对自体CML细胞、K562细胞及HLA相合的健康人的BMMNC杀伤活性比较

　　注：P值为自体CML细胞组分别与K562细胞组及健康人BMMNC之间的比较；K562细胞组与健康人BMMNC相比，P值均＞0.05讨论

　　近年的临床和实验研究均已证实CML患者的骨髓中存在正常的造血祖细胞，使得用良性造血祖细胞重建造血成为可能^［5］。这引起了人们对自体骨髓移植(ABMT)治疗CML的极大关注。但用ABMT治疗CML的关键是CML骨髓的体外净化及良性克隆的筛选扩增。应用自体抗白血病T细胞进行CML骨髓的体外净化或于ABMT后进行过继性免疫治疗是行之有效的措施，但特异性抗白血病T细胞产生的关键是白血病相关抗原及抗原呈递细胞的存在。DC是重要的抗原呈递细胞，它增强T辅助细胞的功能，诱导特异性细胞毒T细胞(CTL)的产生并增强其功能。在GM-CSF、TNF-α及IL-4的存在下可以从人的造血祖细胞中培养出DC^［6］。在本研究中，我们首先从CML-CP患者的外周血中用含有GM-CSF、TNF-α、IL-4的培养基培养出DC(CML-DC)。该DC高表达CD_1a抗原，与正常人DC的表型一致，具有t(9；22)染色体异常。这与Choudhury等^［7］报道的结果一致。我们还观察到CML-DC与IL-2共同诱导的T细胞比单独应用IL-2诱导的T细胞产生更强的对自体CML细胞的杀伤活性。这说明CML-DC一方面由于其起源于白血病祖细胞而可能带有白血病相关抗原，如bcr/abl融合基因的表达产物P210蛋白，T细胞能够对此产生应答；另一方面CML-DC同时也具有正常DC的形态和功能，能够将自身携带的抗原加工处理并呈递给 T细胞，由此产生针对白血病细胞抗原的特异性细胞毒T细胞。我们观察到CML-DC诱导的T细胞对HLA不相合的具有Ph染色体的人K562白血病细胞产生的杀伤活性非常低，这提示用此法诱导的 T细胞杀伤活性受MHC限制，而其对HLA相合的BMMNC的杀伤活性也非常低，体现出CML-DC诱导的T细胞的选择性和特异性抗白血病作用。

　　在CML-CP患者外周血T细胞诱导培养过程中，首先加入IFN-α培养24小时，它能够抑制CML白血病克隆的生长，同时也能促进 T细胞的扩增。再加入IL-2和DC培养1～2周，CD₁₃⁺髓系细胞不到1%，而CD₂⁺T细胞占95%以上。这说明CML外周血T细胞诱导培养过程中存在对白血病细胞的净化。

　　参考文献

　　1　郭宝强，杨金平，李广宙，等. 自体LAK细胞对白血病细胞清除作用的实验研究.中华血液学杂志，1995，16：524-526.

　　2　纪恩美，郭宝强，马传香，等.直接涂片法对急性淋巴细胞白血病进行免疫分型. 中华血液学杂志,1996,17:44-45.

　　3　Weidman E, Brieger J,Jahn B, et al. Lactate dehydrogenase-release assay: a reliable, nonradioactive technique for analysis of cytotoxic lymphocyte-mediated lytic activity against blasts from acute myelocytic leukemia. Ann Hematol,1995,70:153-157.

　　4　薛永权,过宇. 介绍一种改良的骨髓细胞染色体热处理姬姆萨R显带法.中华医学检验杂志,1986,9: 247-249.

　　5　Verfailie CM, Miller WJ, Boylan K, et al. Selection of benign primitive hematopoietic progenitors in chronic myelogenerous leukemia on the basis of HLA-DR antigen expression . Blood,1992，79：1003-1012.

　　6　Romani N, Gruner S, Brang D, et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med, 1994, 180:83-93.

　　7　Choudhury A, Gajewski JL,Liang JC, et al. Use of leukemic dendric cells for the generation of antileukemic cellular cytotoxicity against Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia. Blood, 1997, 89:1133-1142.

收稿：1998-04-20

　　修回：1999-03-01