采用甲基化特异性聚合酶链反应研究急性白血病p15基因CpG岛甲基化

中华血液学杂志 1999年第12期第20卷 专　论

作者：张雨生　楼方定　于力

单位：100853　北京，解放军总医院

　　关键词： 基因，p15；甲基化；聚合酶链反应；白血病，急性

　　【摘要】　目的　探讨p15基因CpG岛甲基化作为各型急性白血病通用的基因标志物的可行性。方法　采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法检测40例初治或复发急性白血病、5例完全缓解期白血病及8例(份)正常骨髓的p15基因CpG岛甲基化，并对MSP产物进行序列测定。结果　急性白血病患者p15基因CpG岛甲基化阳性率为80%，AML与ALL的阳性率(分别为83%和73%)差异无显著性；5例完全缓解期白血病患者中1例p15 CpG岛甲基化阳性(该例患者不久白血病复发)；正常骨髓8例均为阴性，表明p15 CpG岛甲基化为白血病细胞所特有；MSP产物测序结果与理论结果相符合，MSP敏感度可达10^-3。结论　p15 CpG岛甲基化在各型急性白血病中均有很高的发生率，可以作为各型急性白血病通用的微量残留病(MRD)指标；白血病完全缓解期p15 CpG岛甲基化仍为阳性可能预示着复发；MSP法DNA需要量极少，不需要有特异性酶切位点，无同位素污染，对标本要求不高，敏感度高，是甲基化研究的一个简便、敏感、特异的新手段。

Study on the methylation of p15 gene CpG islands in acute leukemia: using methylation-specific PCR method

ZHANG Yusheng, LOU Fangding, YU Li.

　　Department of Hematology, General Hospital of PLA, Beijing　100853

　　【Abstract】　Objective　To explore the feasibility of the methylation of p15 gene CpG islands as a common gene marker for all types of acute leukemias(AL).Methods　The methylation of p15 gene CpG islands in bone marrow from 40 cases of newly diagnosed or relapsed AL, 5 cases of AL in CR and 8 of normal subjects was analyzed by using methylation-specific PCR methods(MSP), and the product of MSP was sequenced.Results　p15 gene CpG islands were methylated in 80% (32/40) of the newly diagnosed or relapsed AL， no difference between AML and ALL was observed. One positive result was found in the 5 AL patients in CR and this patient soon relapsed. The bone marrow cells from 8 normal subjects did not have p15 gene CpG islands methylation, which suggested that such methylation was peculiar to AL cells. DNA sequencing confirmed the right expected sequence. The sensitivity of MSP was 10^-3.Conclusion　The methylation of p15 gene CpG islands occurs very commonly in every types of AL. It can be used as a gene marker for ALs and for minimal residual disease in CR. MSP needs neither special methylation-sensitive restricted sites, nor high volume of DNA. There is no radioactive pollution, and the sample need not be fresh. MSP is a very sensitive, simple and specific method for the detection of DNA methylation.

　　【Key words】　Gene,p15　　Methylation　　Polymerase chain　reaction　　Leukemia, acute

　　p15基因于1994年由Kamb发现，位于染色体9p21，其产物蛋白能抑制CDK(cyclin-dependent kinase)的活性，从而阻止细胞进入增殖周期，此功能与转化因子β(TGF-β)有直接联系^［1］。许多实验显示p15在白血病中表达失活，进一步研究发现其原因在于基因发生了CpG岛的异常甲基化，而并非基因的突变或缺失。我们采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSP)法，对不同类型的急性白血病p15异常甲基化进行了研究。

　　病例和方法

　　1　研究对象　初治或复发急性白血病共40例，均来自解放军总医院，男29例，女11例，年龄10～73岁，均符合FAB诊断和分型标准；其中急性髓系白血病(AML) 24例，急性淋巴细胞白血病(ALL)15例，粒淋混合型1例。完全缓解期白血病5例，其中AML 2例，ALL 3例。正常骨髓8例(份)，取自胸科非血液病手术患者肋骨。Raji细胞取自培养的对数生长期。

　　2　DNA提取　骨髓以肝素抗凝，经Ficoll液分选单个核细胞(MNC)后常规方法提取DNA^［2］；Raji细胞直接提取DNA。紫外分光光度计测定DNA含量，吸光度(A)₂₆₀／A₂₈₀≥1.8。

　　3　PCR引物^［3］　设计p15甲基化引物(p15M)及p15非甲基化引物(p15U)，两组引物由CybenSyn公司合成。其序列为：p15M sense:5′-CCCTTCGTATTTTGCGGTT-3′；p15M antisense:5′-CGTACAATAAACGAACGACCGA-3′，扩增产物148 bp。p15U sense: 5′-TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT-3′；p15U antisense:5′-CCATACAATAACCAAACAACCAA-3′，扩增产物154 bp。

　　4　MSP^［3］

　　4.1　DNA的NaHSO₃处理：取DNA 2 μg溶于25 μl水中，加入0.4 mol/L NaOH 25 μl，37 ℃ 10分钟；再加入10 mmol/L C₆H₆O₂ 30 μl及3 mol/L NaHSO₃ 520 μl，液体石蜡覆盖(隔离空气)，在50 ℃ 16小时反应后冷冻除去液体石蜡，以Wizard DNA Clean-up System除盐；加入等体积0.6 mol/L NaOH, 室温5分钟；再加入等体积6 mol/L NH₄Ac及二倍体积无水乙醇，-20 ℃过夜，12 000 r/min离心10分钟，得DNA沉淀，加入体积分数为70%的冷乙醇，12 000 r/min离心10分钟×2次，弃上清，得DNA沉淀，吹干，30 μl去离子水溶DNA，-20 ℃保存或直接做PCR。

　　4.2　PCR：反应体系为40 μl，含1×缓冲液，MgCl₂ 6.7 mmol/L，引物1.5 pmol/L,dNTP (Promega公司) 1.25 mmol/L, NaHSO₃处理DNA约50 ng；96 ℃预变性5分钟，加入DNA聚合酶(Promega公司) 2.0 U。扩增条件：94 ℃ 45秒，60 ℃ 45秒，72 ℃ 45秒，35个循环，最后1个循环72 ℃延伸7分钟。

　　4.3　MSP产物电泳分析及测序：将MSP产物与上样液按6∶1混合，于20 g/L琼脂糖凝胶上电泳，于凝胶成像系统(UVP，美国)下检测、照相。配制30 g/L的低熔点琼脂糖凝胶，将以p15M为引物的MSP产物与上样液6∶1混合后上样，电泳；以无菌刀片于紫外灯下切取阳性带，置于Eppendorf管中，加入等体积TE，60 ℃ 10分钟熔胶；加入1/10体积3 mol/L NaHAc,顺序以饱和酚、酚-氯仿(体积比为1∶1)、氯仿-异戊醇(体积比为25∶1)抽提，乙醇沉淀后得到MSP产物，电泳证实为所需片段，由中国科学院微生物研究所测定。

　　结果

　　1　各型急性白血病p15的MSP结果　40例初治或复发急性白血病患者MSP阳性率为80%(40例中32例阳性)，其中AML为83%(24例中20例阳性)，ALL为73%(15例中11例阳性)，两型间差异无显著性(P＞0.05)，1例粒淋混合型患者为MSP阳性(图1)；5例完全缓解的患者有1例阳性(该例阳性者不久白血病复发，最终死亡)。

　　M:Marker;1:AML,幼稚细胞98%；2：ALL，幼稚细胞52%；

　　3：AML-CR；Mp：引物为p15M；Up:引物为p15U

1　急性白血病的p15 MSP

　　2　细胞系及正常骨髓细胞的p15 MSP结果　Raji细胞为阳性，8例(份)正常骨髓均阴性。

　　3　MSP敏感度测定　将Raji细胞的DNA以正常骨髓细胞的DNA稀释后再做MSP，结果显示MSP敏感度可达10^-3(图2)。

M：Marker;1～5：Raji细胞稀释至10⁰～10^-4；Mp：引物为p15M；Up：引物为p15U

2　MSP敏感度测定

　　4　MSP产物测序结果　测以p15M为引物的MSP产物的一条链(相当于p15的antisense链)，结果显示，与p15原序列相比，G转化为A，而CG中G仍保持不变。

　　以p15M为引物之MSP产物部分序列与p15原序列的比较(划线及黑体示原序列中的G在MSP产物中转化为A)：

　　MSP产物序列：AACGCGCCTAATTTACTTCTAAAAAAAAAC

　　p15原序列：GGCGCGCCTA GATTGCTTCT

　　GGGAAAAAGC

　　MSP产物序列：GCCTAACGCGAACGCAACCG AACTCAAAAC

　　p15原序列：GCCTAGCGCG GACGCAGCCG

　　AGCTCAAAGC

　　MSP产物序列：CGCTCTAACC GCAAAATACGAACG

　　p15原序列：CGCTCTGGCC GCAGGGTGCGGACG

　　讨　论

　　甲基化修饰是脊椎动物唯一的DNA自然修饰方式，在基因表达的调控、基因结构的稳定等方面有重要作用，与肿瘤的发生发展关系密切。白血病中的甲基化异常主要为某些基因(如p15、p16、ER、Hic1、Calc1等)的CpG岛发生甲基化，致使基因表达封闭，影响细胞的正常功能^［4］。Herman等^［3］在其他实验室研究的基础上总结出甲基化特异性PCR(MSP)方法，其原理为：双链DNA变性解链后，在HSO₃^-作用下发生C→U转化，C若已有甲基化则无此改变；甲基化修饰只发生于5′→3′方向C-G相联结构的C上，因此在HSO₃^-作用后，DNA CpG岛若无甲基化，则序列中的改变为C→U，CG→UG，若有甲基化则为C→U，CG→CG，用不同的引物做PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛甲基化。从理论上说，DNA发生甲基化的MSP产物的序列与原序列比较，变化为C→T，CG→CG，相应其互补链的改变为G→A，CG→CG，本实验的测序结果与理论结果相符合，证实了实验的可靠性。

　　本实验中采用MSP法对不同类型的急性白血病的p15 CpG岛甲基化异常进行了研究，结果显示，80% (40例中32例)的初治或复发急性白血病患者均有p15的CpG岛甲基化，AML与ALL之间无显著差异。

　　本实验结果还表明，MSP的敏感度可达10^-3；正常骨髓无p15的甲基化改变，说明这种甲基化异常是白血病肿瘤细胞所特有的，p15甲基化作为各型急性白血病通用微量残留病(MRD)指标，在特异性和敏感性上均比较理想。实验中检测5例完全缓解急性白血病患者的标本，其中有1例MSP阳性，后此患者白血病复发而死亡。这一结果说明p15甲基化作为急性白血病的MRD指标有一定的实用性。

　　MSP方法的建立为基因CpG岛甲基化研究提供了有效的方法。MSP与普通PCR的主要不同点在于对引物的设计有特殊要求，由于设计了甲基化引物M和非甲基化引物U，二者中至少有一个有扩增，否则即表明MSP失败，这样就无须设定内对照。此方法DNA需要量极少、不需要有特异性酶切位点、无同位素污染、敏感性高、对标本要求不高，陈旧标本，甚至蜡块均可使用。不过，由于MSP扩增产物中A及T比例非常高，与普通PCR相比，扩增条件需做适当的调整。近来Quesnel等^［5］又对MSP略加调整，但主要步骤未做改动。

　　综上所述，我们对急性白血病的p15 CpG岛甲基化进行了研究，结果显示：急性白血病p15 CpG岛甲基化阳性率为80%(40例中有32例)，AML与ALL二型之间阳性率无显著差异，正常骨髓为阴性，表明p15 CpG岛甲基化为白血病细胞所特有，白血病完全缓解期仍为阳性可能预示着复发(例数尚少，需要进一步观察)，p15甲基化可以作为各型急性白血病通用的MRD指标。本实验中采用MSP法，敏感度可达10^-3，MSP产物测序进一步证实了实验的可靠性。

　　参考文献

　　1　Hannon GJ, Beach D. P15INK4B is a potential effector of TGF-β-induced cell cycle arrest. Nature, 1994, 371:257-261.

　　2　Maniatis T, Fritsch E, Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 425-427.

　　3　Herman JG, Graff JR, Myohanen S, et al. Methylation-special PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:9821-9826.

　　4　Issa JP, Baylin SB, Herman JG. DNA methylation changes in hematologic malignancies: biologic and clinical implications. Leukemia, 1997, 11 Suppl 1:s7-11.

　　5　Quesnel B, Guillerm G, Vereecque R, et al. Methylation of the p15 INK4b gene in myeloidsplastic syndromes is frequent and acquired during disease progression. Blood, 1998, 91:2985-2990.

收稿：1999-04-09　　修回：1999-08-05