抗氧化剂槲皮素诱导人白血病HL-60细胞凋亡作用

中华血液学杂志 2000年第6期第21卷 研究报告

作者：李忌　陈俊杰　高小平　周健　罗弟祥　李伯刚

单位：李忌　陈俊杰（610041　成都，华西医科大学基础医学院医学分子生物学开放实验室）；高小平　周健　罗弟祥　李伯刚（中国科学院成都地奥制药公司新药部）

　　槲皮素（quercetin，Que）是一种存在于多种植物中的黄酮类化合物，有较强的抗氧化作用^［1］。以往的研究结果表明，Que可抑制多种肿瘤细胞的生长，且可加强某些抗癌药物的抗癌作用^［1，2］；Que对白血病细胞的DNA合成有抑制作用^［3］。因而，Que被认为是颇具应用前景的抗癌药物或抗癌辅助药物，但Que的作用机制尚未阐明。我们的研究结果显示，Que可有效诱导人白血病HL-60细胞发生凋亡，且引发抗凋亡基因bcl-2的蛋白发生降解。

材料和方法

　　1　试剂　Que、噻唑蓝（MTT）及碘化丙锭（PI）为Sigma公司产品，其它常用试剂均为国产分析纯。

　　2　细胞培养及存活率测定　HL-60细胞由本室长期传代，以1×10⁵/ml浓度接种于含体积分数为10%的灭活胎牛血清(FCS)，100U/ml 青霉素，100μg/ml 链霉素的新鲜RPMI 1640（Gibco公司产品）培养液中培养（37℃，体积分数为5%的CO₂）。采用MTT法测定细胞存活率^［4］。

　　3　细胞形态学观察　HL-60细胞与一定浓度Que共同培养不同时间后，于倒置显微镜下观察或制成细胞涂片，经Giemsa染色后于光镜下观察。

　　4　流式细胞仪计数分析^［5］　收集细胞，用体积分数为70%的乙醇4℃固定4h后，加入RNA酶（终浓度为50μg/ml） 37℃反应1h，再用PI（浓度为100μg/ml）溶液染色20～30min后，用流式细胞仪（Becton Dickinson 公司，美国）分析。

　　5　细胞DNA片段化分析　收集细胞(10⁶个细胞以上)，加入裂解液(10g/L NP40,20mmol/L EDTA,50mmol/L Tris-HCl，pH7.5)反应10s。离心收集上清，加入SDS至10g/L浓度，并用RNA酶(终浓度50μg/ml)56℃作用1～2h，然后再加入蛋白酶κ至2.5mg/ml，37℃处理2h，用乙醇沉淀DNA，用10～20μl TE溶解DNA，在10g/L琼脂糖凝胶中电泳。

　　6　Western blot分析^［6］　提取经Que处理后的细胞总蛋白质，用BCA检测试剂盒（Sigma公司）进行定量。取30μg蛋白质样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，120g/L），转膜，按照ECL Western blot试剂盒（Amershan公司）的程序进行Western blot，第一抗体为兔抗人Bcl-2单抗（Santa公司）。

结 果

　　1　Que抑制HL-60细胞增殖　不同浓度Que对HL-60细胞生长有抑制作用，这种作用呈时间、剂量依赖性。随Que浓度的增加细胞存活率降低(见图1)。时效关系曲线与量效关系曲线相似。

　　2　Que对HL-60细胞形态学影响　经100μmol/L Que处理HL-60细胞24h后，HL-60细胞表现凋亡细胞的特征性形态变化：细胞体积缩小、细胞核固缩、膜起泡、核断裂及形成凋亡小体等。

　　3　流式细胞仪分析HL-60细胞DNA含量　经不同浓度Que处理后的HL-60细胞，可见DNA含量低于G₁期的凋亡细胞群，这群细胞的百分率随Que浓度的递增而增加（图2）。

　　4　DNA电泳　100μmol/L的Que处理HL-60细胞24h和48h后，DNA琼脂糖凝胶电泳显示梯状降解条带。

　　5　Que使Bcl-2发生降解　HL-60是一种Bcl-2高表达的细胞系^［7］，经Western blot分析，我们发现100μmol/L Que处理HL-60细胞24h或48h，均导致Bcl-2发生降解（图3），与标准分子量Marker比较并计算得知：大片段相对分子质量为25×10³，类似于Bcl-2α同工酶^［8］；小片段为20×10³。目前，它的功能还不得而知。

图1　不同浓度Que作用于HL-60细胞24h的量效关系曲线

图2　流式细胞仪分析HL-60细胞凋亡情况

1：对照组；2：100μmol/L Que处理24h；3：100μmol/L Que处理48h

3　Western blot分析Bcl-2降解情况

讨 论

　　本研究结果表明，Que在100 μmol/L时能有效诱导HL-60细胞发生凋亡，表现为：①形态学上细胞体积缩小、核浓缩致密及凋亡小体形成；②琼脂糖凝胶电泳有梯状条带出现；③流式细胞术检测有亚G₁峰出现。并且这种凋亡的作用有时间和浓度依赖性，Western blot检测发现Que诱导HL-60细胞凋亡过程中，引发Bcl-2蛋白降解为相对分子质量为25×10³和20×10³的片段。

　　有关Que诱发Bcl-2降解的研究尚未见报道。Bcl-2的降解提示有相关蛋白酶的激活，凋亡发生是一个复杂的由caspases家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，相对分子质量为20×10³的降解产物的产生还不知是何种caspases激活所致^［8］。不同类型细胞由于其生物学特性不同，发生凋亡时可能存在不同的蛋白酶激活，Bcl-2也可能作为多种蛋白酶的底物被降解。Que诱发HL-60细胞的Bcl-2发生降解，可能是激活了相关蛋白酶，具体机制有待进一步研究。

　　我们根据自己及其他实验室的实验结果提出：细胞氧化还原平衡状态的改变是导致细胞凋亡的重要原因，因此，抗氧化剂Que诱导HL-60细胞发生凋亡可能与它改变细胞氧化还原状态的平衡有关。

　　参考文献

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　　2，Elia G, Santoro MG. Regulation of heat shock protein synthesis by quercetin in human erythroleukaemia cells. Biochem J, 1994, 300:201-209.

　　3，Uddin S, Chaudhry MA. Quercetin, a bioflavonoid, inhibits the DNA synthesis of human leukemia cells. Biochem Mol Biol Int, 1995, 36:545-551.

　　4，王振华，李忌，郑荣梁，等. 菰帽悬钩子三萜糖酯的体外抗肿瘤活性. 中国药学杂志, 1999, 34:163-164.

　　5，Li X, Melamed MR, Darzynkiewicz Z. Detection of apoptosis and DNA strand breaks with fluorochromes of different color. Exp Cell Res, 1996, 222:28-37.

　　6，Grandgirard D, Studer E, Monney L, et al. Alphaviruses induce apoptosis in Bcl-2-overexpressing cells:evidence for a caspase-mediated, proteolytic inactivation of Bcl-2. EMBO J, 1998, 17:1268-1278.

　　7，Kawaii S, Tomono Y, Katase E, et al. Acridones as inducers of HL-60 cell differentiation. Leukemia Res, 1999, 23:263-269.

　　8，Yamamoto AM, Eloy L, Bach JF, et al. N-terminus cleavage of bcl-2 by a novel cellular non-ICE cysteine proteinase. Leukemia, 1998, 12:1467-1472.

　　9，Slater AFG, Nobel CSI, Orrenius S. The role of intracellular oxidants in apoptosis. Biochim Biophys Acta, 1995, 1271:59-62.

(收稿日期：1999-06-25)