47例儿童急性淋巴细胞白血病IgH和TCR基因重排

中华儿科杂志 1998年第6期第36卷 论　　著

作者：步嵘　王耀平　林梓

单位：200092 上海第二医科大学附属新华医院

关键词：白血病；淋巴细胞；急性；基因重排；T淋巴细胞；聚合酶链反应

　　 　　【摘要】　目的　检测47例儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)IgH和TCR基因重排，以便选择恰当的组合用于微小残留病(MRD)的检测。方法　以Chelex 100为介质，从初诊的ALL患儿骨髓涂片中提取DNA，借助聚合酶链反应(PCR)技术检测IgH、TCRβ、TCRδ和TCRγ基因重排。结果　在B-ALL(42例)中，IgH、TCRβ、TCRδ和TCRγ基因重排的检出结果分别为32/42(74%)例、15/42(36%)例、19/42(45%)例和15/42(36%)例。42例中，33例至少出现一种重排，出现两种或两种以上重排的有22例。在T-ALL(5例)中，IgH、TCRβ、TCRδ和TCRγ基因重排的检出结果分别为3/5例、4/5例、2/5例和1/5例。5例均至少出现一种重排，出现两种或两种以上重排的有3例。5例T-ALL中，用TCRγ、TCRδ和TCRβ D₂J₂引物组合至少检出一种单一条带重排的有3例，而再增加IgH引物时为4例。42例B-ALL中，上述不同引物组合至少有一种单一条带重排的检出例数分别为21例(50%)和30例(71%)。结论 用TCRβ D₂J₂、TCRδ和TCRγ基因重排为MRD检测的标记，必要时可辅以IgH基因重排。

The IgH and TCR gene rearrangements in 47 childhood patients with acute lymphoblastic leukemia

Bu Rong, Wang Yaoping, Lin Zi. Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092

　　【Abstract 】　Objective　To study the IgH and TCR gene rearrangements at diagnosis in 47 childhood patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) in order to choose optimal primers to detect MRD. Methods　After extraction of DNA from stored bone marrow smears at diagnosis with chelex 100, IgH, TCRβ, TCRδ and TCRγ gene rearrangements were detected by using polymerase chain reaction (PCR) technique. Results　In 42 B-ALL, clonal gene rearrangements of IgH, TCRβ, TCRδ and TCRγ were detected in 32/42(74%), 15/42(36%), 19/42(45%) and 15/42(36%), respectively. Thirty-three of the 42 cases had at least one of the clonal gene rearrangements. Two or more of the clonal gene rearrangements appeared in 22/42 cases. In 5 T-ALL, clonal gene rearrangements of IgH, TCRβ, TCRδ and TCRγ were detected in 3/5, 4/5, 2/5 and 1/5, respectively. All of the 5 cases had at least one of the clonal rearrangements. Two or more of rearrangements appeared in 3/5 cases. The frequencies of one band amplified by using TCRβ D₂J₂, TCRδ or TCRγ primers were 3/5 in T-ALL and 21/42(50%) in B-ALL. The frequencies of one band amplified by using TCRβ D₂J₂, TCRδ or TCRγ or IgH primers were 4/5 in T-ALL and 30/42(71%) in B-ALL. Conclusion　It is optimal to detect MRD by using PCR-mediated amplification of TCRβ D₂J₂, TCRδ and TCRγ gene rearrangements, then IgH gene rearrangement if it is necessary.

　　 　　【Key words 】　【Key words 】　Leukemia, lymphocystic, acute　　Gene rearrangement, T-lymphocyte　　Polymerase chain reaction

　　应用聚合酶链反应(PCR)技术检测急性淋巴细胞性白血病(ALL)细胞IgH和T细胞受体(TCR)克隆性基因重排的研究已有不少报道。以往被检测的样本主要来自新鲜或冻藏的骨髓液，而用储存的骨髓涂片以Chelex 100 为介质提取DNA，进行PCR扩增对儿童患者进行全面的相关检测尚未见有报道。我们在以往工作的基础上用该技术检测了47例ALL患儿骨髓涂片标本的IgH、TCRβ、TCRγ和TCRδ基因重排，以便选择恰当的组合用于肿瘤微小残留病(MRD)的检测。

　　 材料和方法

　　一、材料

　　标本来自上海第二医科大学附属新华医院1996年3月～1997年5月47例儿童ALL患儿未染色的骨髓涂片，其中B-ALL 42例，T-ALL 5例。

表1　47例ALL患儿TCRβ基因不同重排形式及其单一条带重排的检出结果

　　注：括号内为单一条带检出例数　　二、DNA提取

　　1. 用清洁无污染的手术刀片刮取0.5～1.0 cm²骨髓涂膜（视厚度而定）置于Eppendorf管中，加去离子水300 μl，间歇振荡30分钟。

　　2. 15 000 r/min离心5分钟，弃上清液，加10% Chelex 100介质200 μl ，56℃温育30分钟。

　　3. 超速振荡15秒，沸水浴8分钟，15 000 r/min离心5分钟，上清液即可作为模板进行PCR扩增^［1，2］。

　　三、PCR 引物及产物

　　1. 以FR3A、LJH和VLJH^［3］为引物，用半筑巢式PCR检测IgH基因重排，典型产物为100 bp左右的条带，可为一条或多条。

　　2. 检测TCRβ基因重排的引物有5条，分别为V、D₁、D₂、J₁、 J₂，分别扩增VJ₁、VJ₂、D₁J₁、D₁J₂、D₂J₁和D₂J₂重排片段，所得的产物为55～90 bp^［4］。

　　3. 检测TCRγ基因重排的引物为混合引物，其中V区的V₂、V₃、V₄、V₈、V₉和J区的JGT_1、2，JGT₃，JGT₄引物组成混合引物Ⅰ；V区的V₅、V₁₀、V₁₁、V₁₂和J区的JGT_1、2，JGT₃，JGT₄引物组成混合引物Ⅱ。先用混合引物Ⅰ扩增，阴性标本再用混合引物Ⅱ扩增，阳性条带位于170～230 bp之间^［3］。

　　4. TCRδ基因重排的检测引物分别为V₂和D₃，扩增产物为140 bp左右^［5］。上述引物由赛百胜（美国）公司合成。

　　四、PCR方法

　　1. PCR反应体系为25 μl，含模板DNA 5 μl，10×buffer 2.5 μl，dDTPs 200 μmol/L，引物15 pmol,Taq酶 0.5 U。每管加等体积无菌石蜡油。

　　2. PCR循环程序为：94℃预变性5分钟，然后94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，最后1个循环结束时，72℃再延长10分钟。其中在检测IgH基因重排的第2轮扩增时，复性温度升至60℃，余不变。循环圈数在检测TCR β基因重排时为40圈，余为35圈。

　　五、产物检测

　　取20 μl产物，于8%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳：150 V，2小时，EB染色后紫外灯下观察并拍照。

　　 结果

　　一、B-ALL各项重排的检出结果

　　32/42(74%)例检出IgH基因重排。15/42(36%)例检出TCRβ基因重排（具体不同重排形式的检出结果见表1）。15/42(36%)例检出TCR γ基因重排。19/42 (45%)例检出TCR δ基因重排。在全部42例标本中，33例至少出现一种重排，出现两种或两种以上重排的有22例。

　　二、T-ALL各项重排检出结果

　　5例中检出IgH重排的有3例，检出TCRβ重排的有4例，检出TCRγ重排的有1例，检出TCRδ重排的有2例。在全部5例标本中均至少出现一种重排，出现两种或两种以上重排的有3例。

　　三、单一条带检出结果

　　各重排形式单一条带的检出结果见表1、2。

　　T-ALL患儿中，用TCRγ、TCRδ和TCRβ的D₂J₂引物组合至少检出一种单一条带重排的有3例，而再增加IgH引物时为4例。而B-ALL患儿中，上述不同引物组合的至少一种单一条带重排检出例数分别为21/42例(50%)和30/42例(71%)。

表2　47例ALL患儿IgH、TCRγ和TCRδ单一条带重排检出结果

　　四、统计学处理结果

　　经χ²检验，IgH、TCRγ、TCRδ基因重排检出结果及其单一条带重排检出结果在T-ALL和BALL-ALL标本之间的差异无显著性，P均＞0.05。同样，TCRβ基因不同重排形式的检出结果及其单一条带重排检出结果在T-ALL和B-ALL标本之间的差异也均无显著性，P均＞0.05。

　　 讨论

　　Chelex 100为介质提取DNA进行PCR扩增，国外已用于法医学的痕迹检验中。该方法具有标本要求量少，保存条件要求不高，操作步骤少，省时且不易污染，借助适当的载体，如清洁无菌纱布等，标本可邮寄。扩大了临床应用的服务范围，有很高的实用价值。

　　本组42例B-ALL中，IgH和TCRγ基因重排的检出率稍低于国外的有关报道，而TCRβ和TCRδ的结果国内外基本相似^［6］，这可能与引物不完全一样有关。其中，TCRβ基因重排中未获得D₁J₁和 D₂J₁重排的阳性扩增产物，这与国外文献报道的一致^［3］。由于某些骨髓涂片储存时间较长，DNA可能出现不同程度的降解，故可能导致本组数据稍低于实际情况。

　　本组T-ALL的各项指标的检出率均低于国外的有关报道^［6，7］，除引物不完全一样外，还与样本量少有关。

　　经χ²检验，T-ALL和B-ALL的各项重排指标之间检出率差异均无显著性，由于国内外鲜见有此类报道，且T-ALL标本少，实际情况究竟如何，需进一步扩大样本加以验证。

　　从本组B-ALL的数据来看，21/42例(50%)至少出现TCRβ D₂J₂、TCRγ和TCRδ三种基因中的一种重排，且至少有一种的PCR产物为单一条带；而在T-ALL中3/5例至少出现一种单一条带的重排。结合IgH重排的情况，在B-ALL中，至少出现一种单一条带重排的可达30/42例(71%)，而T-ALL则为4/5例。在以IgH和TCR基因重排为标记进行MRD检测时，因肿瘤细胞的寡克隆性可导致假阴性结果^［6，7］，因此，如何选择引物组合减少寡克隆性重排的出现，关系到临床实际应用的可靠性。故仅从本组数据的结果来看，可考虑首选TCRβ D₂J₂、TCRδ和TCRγ基因重排为MRD的检测标记，必要时辅以IgH基因重排。考虑到IgH基因重排的检测要进行2轮扩增，费时，操作步骤多，易污染，故在实际应用中首选前三种重排中单一条带为跟踪标记，最后考虑IgH重排。

　　国内儿童克隆衍化需进一步深入研究，以选择最佳组合，减少因克隆衍化而造成的假阴性。此外，由于病例数少，国内儿童ALL患者上述基因重排特点究竟如何，尚需继续扩充病例深入研究。

参考文献

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　　2　Sepp R, Szabo I, Uda H, et al. Rapid techniques for DNA extraction from routinely processed archival tissue for use in PCR. J Clin Pathol, 1994, 47:318-323.

　　3　Trainor KJ, Brisco MJ, Wan JH, et al. Gene rearrangement in B- and T-lymphoproliferative disease detected by the polymerase chain reaction. Blood,1991,78:192-196.

　　4　McCarthy KP, Sloane JP, Kabarowski JH, et al. The rapid detection of T-cell proliferation in patients with lymphoid disorders. AM J Pathol, 1991,138:821-828.

　　5　Steward CG, Goulden NJ, Katz F, et al. A polymerase chain reaction study of the stability of Ig heavy-chain and T-cell receptor delta gene rearrangements between presentation and relapse of childhood B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1994,83:1355-1362.

　　6　vanDongen JJ, Breit TM, Adriaansen HJ, et al. Detection of minimal residual disease in acute leukemia by immunological marker analysis and polymerase chain reaction. Leukemia, 1992, 6(Suppl):47-59.

　　7　Potter MN, Cross NC, van Dongen JJ, et al. Molecular evidence of minimal residual disease after treatment for leukemia and lymphoma: an updated meeting report and review. Leukemia,1993, 7:1302-1314.