急性淋巴细胞白血病微量残留病动态监测的研究

中华儿科杂志 1999年第5期第37卷 论　著

作者：谷仁凯　卢洁　孙立荣　董增义　雷炜　庞秀英　佟琳如　周容

单位：266003 青岛大学医学院附属医院儿内科

关键词：白血病；淋巴细胞；急性；肿瘤；残余；聚合酶链反应；姐妹染色单体交换

　　【摘要】　目的　探讨采用筑巢式聚合酶链反应（Nested-PCR）等多项指标监测小儿急性淋巴细胞白血病（ALL）微量残留病（MRD）的临床意义。方法　98例ALL进行了形态学、免疫学和细胞遗传学（MIC）分型，结合Nested-PCR、姐妹染色单体交换（SCE）、染色体核型分析，对58例ALL进行MRD监测。结果：(1)58例ALL进行了T细胞受体（TCR）Vδ₂Dδ₃基因重排检测，在41例B-ALL中34例（83%）及4例T-ALL中1例具有此基因重排。检测敏感度为10^-5～10^-6。(2)58例ALL中44例ALL进行了MRD-PCR动态监测。结果显示，维持强化治疗期间PCR检测由阴性转为阳性或持续阳性者，易引起骨髓复发死亡，提示预后较差。PCR检测转阴时间有明显的个体差异性，持续完全缓解（CCR） 3年以上的ALL患儿PCR持续转阴可作为停用化疗药的可靠指标。(3)50例ALL进行了SCE的动态监测，初发组SCE频率高于CR组，差异有非常显著意义（P＜0.001）。部分缓解组显著高于CR组（P＜0.01），SCE频率变化与疾病的严重程度呈平行关系。(4)初发ALL中无论染色体核型正常或异常其SCE频率均显著增高，两者无显著性差异（P＞0.05），表明均有DNA严重损伤。结论　在MIC分型诊断的基础上，采用Nested-PCR、SCE、染色体核型分析等指标进行ALL的MRD动态监测，综合分析评价，对指导治疗、预测复发、决定终止化疗时间及判断预后有临床意义。

　　The study of dynamic detection of minimal residual disease in children with acute lymphoblastic leukemia GU Renkai, LU Jie, SUN Lirong, et al. Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003

　　【Abstract】　Objective　To explore the clinical significance of detecting minimal residual disease (MRD) in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL) by using the methods of nest-polymerase chain reaction (Nest-PCR) and other detecting indexes.Methods　Based on the morphological, immunological and cytogenetic (MIC) classifications along with the detection of Nest-PCR, the frequency of the sister chromatid exchange (SCE) and the chromosome karyotype analysis, 98 children with ALL were classified and 58 of 98 patients with ALL were detected for MRD.Results　① Fifty-eight patients with ALL were detected for gene rearrangements of T cell receptor (TCR) Vδ2-Dδ3. Thirty-four of 41 patients with B-ALL (82.9%) and 1 of 4 patients with T-ALL were found with the gene rearrangement. The detecting senstivities of MRD were 10^-5～10^-6. ② Forty-four of 58 patients with ALL were detected dynamically for MRD. During intensive therapy, the patients with the positive PCR results converted from the negative and with the persistant positive PCR results preferred to relapse in bone marrow, which would induce death and indicate a poor prognosis. The time of PCR results turned to negative was different individually. It might be an indicator of terminating chemotherapy that the MRD was undetectable in ALL patients with continued complete remission (CCR) for more than 3 years. ③ The frequencies of SCE of bone marrow cells in 50 patients with ALL were detected dynamically. The frequencies of SCE in patients with primary ALL and patients with partial remission were higher than patients with complete remission (CR) (P＜0.001 and P＜0.01, respectively). The frequency of SCE was associated with the severity of the disease. ④ In patients with primary ALL, the frequencies of SCE were increased both in the groups of normal and abnormal chromosome karyotype (P＞0.05).Conclusion　Based on the typing and diagnosis of MIC, the combination of PCR, SCE and chromosome karyotype analysis would play important roles in guiding treatment, predicting bone marrow relapse, determining the time of terminating chemotherapy and evaluating prognosis.

　　【Key words】　Leukemia, lymphocytic, acute　　Neoplasm, residual　　Polymerase chain reaction　　Sister chromatid exchange

　　国内外采用筑巢式聚合酶链反应（Nested-PCR）检测白血病微量残留病（MRD），以其灵敏、特异而日益受到重视。但目前多为一次性检测或单项PCR指标动态监测MRD。我们应用Nested-PCR、姐妹染色单体交换（SCE）、染色体核型分析、免疫分型及形态学分型相结合的方法，对98例小儿急性淋巴细胞白血病（ALL）进行分型诊断和MRD监测的研究，以探讨对指导临床治疗、预测骨髓复发、决定终止化疗时间和判断预后的临床意义，现将结果报告如下。

　　对象和方法

　　一、对象

　　1980年1月～1997年12月在我院就诊的98例ALL患儿（L₁型21例、L₂型75例、L₃型2例）。男66例，女32例。年龄1～13岁，中位年龄6岁。

　　二、免疫学分型

　　标本取自骨髓，采用间接免疫荧光方法。阳性细胞＞30%为阳性标准。单克隆抗体（McAb）中B系列有DR、CD₁₉、CD₁₀、CD₂₀、μ、κ、λ;T系列有CD₅、CD₇、CD₂、CD₃、CD₄、CD₈、T₉。

　　三、染色体制备及分析

　　染色体标本取自骨髓，ALL经24～72小时培养后按常规法收集细胞，制片，经G显带。根据国际人类细胞遗传学命名法进行染色体中期分裂相核型分析。

　　四、SCE频率分析

　　经培养、制片、SCE分色和计数，镜检时每例分析20～50个分散良好的中期分裂相，计数SCE频率（每个中期相和每条染色体）。

　　五、Nested-PCR检测

　　所用标本为ALL患儿的骨髓液或骨髓涂片，分别参照文献［1，2］提取骨髓液或骨髓涂片中的DNA。采用Nested-PCR技术扩增T细胞受体（TCR）Vδ₂Dδ₃基因重排片断^［3］。所用寡核苷酸引物由北京医科大学提供，2对引物序列为：

　　外侧引物：5′-TCA TCC ATC TCT CTC TCT TC-3′

　　5′-AAA TGC TAG CTA TTT CAC CCA-3′

　　内侧引物：5′-GCA CCA TCA GAG AGA GAT GA-3′

　　5′-TTG TAG CAC TGT GCG TAT CC-3′

　　每次实验均设阳性、阴性对照。阳性对照来自诊断明确并具有TCRVδ₂Dδ₃基因重排ALL患儿的骨髓DNA。阳性条带清晰、光亮；如条带弥漫或无特异性条带形成则为阴性。

　　六、统计学处理

　　实验数据以平均数±标准差（±s）、中位数（M）和例数（n）表示；各组显著性分析采用秩和检验。

　　结　果

　　一、免疫学分型

　　85例ALL进行了免疫学分型检查，其中81例为非T-ALL。按六型分类法^［4］，BⅠ型4例，BⅡ型6例，BⅢ型41例，BⅣ型26例，BⅤ型3例，BⅥ型1例；4例T-ALL，按三型分类法^［5］，TⅡ型3例，TⅢ型1例。

　　二、染色体分析

　　98例ALL进行了181例次的染色体检查。82例ALL在确诊时进行了染色体检查，结果为正常核型40例，异常核型42例（51%），其中数目异常25例，结构异常1例，数目及结构均异常6例。41例ALL在疾病过程中进行了染色体动态观察，共查染色体124例次。41例ALL分三组进行动态观察：(1)非T-ALL初发时染色体核型正常组；(2)非T-ALL初发时染色体核型异常组；(3)T-ALL组。结果显示，初发时染色体核型正常的非T-ALL比核型异常的非T-ALL完全缓解(CR)率高，中位存活期长，死亡率低。非T-ALL伴有6q-核型的预后较好，伴有亚二倍体者预后较差，与文献报道结果相一致^［6，7］。

　　三、SCE频率分析

　　50例ALL患儿接受SCE检测，总检126例次。根据不同的临床转归将其分为三组：初发组、部分缓解（PR）组及CR组。同时检测21例正常人作为对照组。各组SCE频率结果见表1。

　　　　表1　ALL各组SCE频率结果(±s)

　　注：表中4组比较，H=46.44，P＜0.001；组间两两比较：d₁₂(第1、2组平均等级差)=69.71，P＜0.001；d₁₃=75.32，P＜0.001；d₁₄=19.36，P＞0.05；d₂₃=5.6，P＞0.05；d₂₄=50.35，P＜0.001；d₃₄=55.96，P＜0.01　　结果显示：ALL初发时骨髓细胞SCE水平的损伤严重，即DNA损伤严重；CR时SCE频率降低，DNA得到一定修复，两组间比较差异有非常显著意义(d₂₄=50.35，P＜0.001)；PR组与CR组比较差异也有非常显著意义(d₃₄=55.96，P＜0.01)；CR组SCE频率仍高于对照组，但两组间无显著性差异(d₁₄=19.36，P ＞0.05)。以上结果表明DNA的损伤需要有一个逐渐修复的过程。

　　50例初发ALL患儿中，正常核型与异常核型病例间的SCE频率无显著性差异（P＞0.05）。表明初发病例无论是否有染色体畸变，其SCE频率均显著增高，反映了正常染色体核型病例亦有SCE水平的严重损伤^［8］。

　　四、Nested-PCR检测

　　1. Nested-PCR检测结果：Nested-PCR扩增TCRVδ₂Dδ₃基因重排片断，经电泳分析阳性产物为80 bp的DNA片断。58例ALL进行了169例次TCRVδ2Dδ₃基因重排检测。在41例B-ALL中，34例（83%）和4例T-ALL中1例检出克隆特异性TCRVδ2Dδ₃基因重排。

　　2. MRD动态检测结果：58例ALL中44例ALL进行了155例次的MRD动态监测，实验敏感度达10^-5～10^-6，动态监测结果见表2。

　　　　表2　44例ALL患儿MRD的PCR动态检测结果与生存关系

PCR检测结果	例 　　数	生存时间(月)			转归例数
		±s	M	范围	CR	死亡
阳性→阴性	9	103±76	111	8～216	9	0
阳性→弱阳性	6	68±24	70	37～　92	6	0
	12	54±33	56	12～108	11	1
阳性→阳性	14	41±29	30	10～　99	10	4
阴性→阴性	3	88±88	44	28～189	2	1
合计	44	64±51	52	8～216	38	6

　　表2所示：(1)9例ALL于CR后PCR检测由阳性转为阴性，转阴时间为6～110个月，中位转阴时间49个月。9例ALL中除3例仍在治疗外，其余6例均已停药观察，至今已无病存活79-216个月，中位存活期126个月；(2)14例ALL的PCR检测持续阳性，其中存活5年以下的11例ALL患儿，存活期10～54个月，中位存活期27个月，有4例骨髓复发死亡。存活5年以上的3例ALL患儿，存活期分别为76、91、99个月，PCR检测虽呈持续阳性反应，但仍处于CR状态；(3)3例ALL初次TCRVδ2Dδ₃基因重排检测及PCR动态监测始终呈阴性反应，表明此3例ALL无TCRVδ2Dδ₃基因重排。

讨　论

　　一、SCE频率动态观察的临床意义

　　SCE是体细胞有丝分裂中姐妹染色单体相同位置之间的物质交换，其形成与DNA损伤修复有密切关系。本研究对50例ALL进行了骨髓细胞SCE频率的动态观察分析，结果显示，初发组、PR组的SCE频率增高，与CR组比较差异有非常显著意义（P＜0.001，P＜0.01）。表明ALL患儿治疗前骨髓细胞SCE水平的损伤严重，反映了ALL可能存在着DNA损伤和修复机制的缺陷。CR组SCE频率仍较对照组高，表明其DNA损伤未完全修复，需有一个逐步恢复的过程。

　　二、PCR检测MRD的临床意义

　　MRD是导致白血病复发的根源，PCR检测克隆特异性基因重排标志是最敏感而特异的方法，并认为绝大多数B系ALL有免疫球蛋白重链（IgH）和TCRδ基因重排。本研究采用TCRVδ₂Dδ₃基因重排特异性标志对58例ALL进行MRD的PCR检测，结果显示41例中34例（83%）的B-ALL和4例中1例患儿的T-ALL中有TCRVδ2Dδ₃重排。TCRVδ2Dδ3重排在B-ALL中发生率高，T-ALL发生率低，与文献报道相一致^［9，10］。

　　经本组PCR动态检测结果分析，认为：(1)持续完全缓解(CCR)3年以上的ALL患儿PCR检测转阴可作为停药治疗的可靠指标，如6例PCR检测转阴患儿，停止化疗后观察至今，已无病存活79～216个月，中位存活期125.5个月；(2)PCR转阴时间有明显的个体差异性。9例患儿PCR转阴时间为6～110个月，中位转阴时间49个月。这可能与自身免疫功能清除白血病细胞的能力及化疗强度有关。提示应采用个体化治疗方案；(3)维持强化治疗期间PCR由阴性转为阳性或持续阳性者，易引起骨髓复发死亡，提示预后较差。认为此类患儿体内残留的恶性细胞克隆具有较强的耐药性和增殖活性，应加强化疗强度或改用更有效的化疗方案，使PCR尽快转阴，以防止骨髓复发；(4)PCR阳性的长期无病存活患儿，转归有两种可能性，一是存在复发的可能性;另一转归可能因残留白血病细胞本身或增殖微环境恶化而改变，使之失去增殖活性，多年后自然转为阴性^［11］。

　　三、PCR、SCE、染色体分析三种指标动态监测MRD的评价

　　Nested-PCR检测是一种高度敏感和特异的分析方法,MRD检测可达10^-5～10^-6水平。CCR 3年以上的ALL患儿PCR持续转阴可作为停药治疗的可靠指标。但PCR定性检测不能精确的反映治疗过程中MRD量的变化，最好进行MRD定量监测。而SCE频率变化与疾病的严重程度呈平行关系，对预测骨髓复发有一定的临床价值。若Nested-PCR、SCE、染色体核型分析三者结合检测，综合分析评价，对指导临床治疗、预测复发、决定化疗终止时间和判断预后可能有更重要的临床实用价值。

　　参考文献

　　1　Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 464-467.

　　2　Fey MF, Pilkingtin SP, Summers C, et al. Molecular diagnosis of haematological disorders using DNA from stored bone marrow slides. Br J Haematol, 1987,67:489-492.

　　3　Yokota S. Hansen-Hagge TE, Ludwig WD, et al.Use of polymerase chain reactions to monitor minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia patients. Blood,1991,77:331-339.

　　4　Drexler HG, Gignac SM, Minowada J. Routine immunophenotyping of acute leukemias. Blut,1988,57:327-339.

　　5　Reinherz EL, Kung PC, Goldstein G, et al. Discrete stages of human intrathymic differentiation:analysis of normal thymocytes and leukemic lymphoblasts of T-cell lineage.Proc Natl Acad Sci USA,1980,77:1588-1592.

　　6　谷仁凯，卢洁，孙立荣，等. 小儿急性白血病形态学、免疫学、细胞遗传学的动态观察研究 .白血病，1995，4：153-157.

　　7　郭淑芬，裴仁治，徐淑芝，等. 小儿急性白血病染色体与临床及预后关系的研究.中华儿科杂志，1990，28：11-14.

　　8　卢洁，周容，谷仁凯，等. 小儿急性白血病姐妹染色单体交换动态观察的研究. 中华血液学杂志，1994，15：464-465.

　　9　李昕权，杨爱德，费洪宝，等. 用筑巢式PCR扩增骨髓玻片DNA中T细胞受体基因Vδ2-Dδ3重排片断. 中华医学遗传学杂志，1994，11：176-177.

　　10　Biondi A, Di Celle PF, Rossi V, et al. High prevalence of T-cell receptor Vδ2-(D)-Dδ3 or Vδ1/2-Dδ3 rearrangements in B-precursor acute lymphoblastic leukemias. Blood,1990,75:1834-1840.

　　11　Nizet Y, Van Daele S, Lewalle P, et al. Long-term follow-up of residual disease in acute lymphoblastic leukemia patients in complete remission using clonogenetic IgH probes and the polymerase chain reaction. Blood,1993,82:1618-1625.

(收稿：1998-05-18　修回：1998-09-10)