急性早幼粒细胞白血病发病及诱导分化机制研究进展

　　中华血液学杂志CHINESE JOURNAL OF HEMATOLOGY

　　1999年第20卷第12期vol.20No.12 1999

刘廷析　茅矛　陈竺　王振义

　　关键词：急性早幼粒细胞白血病（APL） 诱导分化 治疗

　　急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是临床上第一个应用诱导分化治疗取得成功和第一种针对肿瘤特异性标志分子进行治疗的人类恶性肿瘤。95%以上APL患者具有特征性的非随机染色体t（15；17）。该易位使15号染色体上的早幼粒细胞白血病（PML）基因与17号染色体上的维甲酸受体α（RARα）基因发生融合，表达PML-RARα融合蛋白^［1］。少数变异型APL患者产生t（11；17），该易位使11号染色体上的早幼粒细胞白血病锌指（PLZF）基因与17号染色体上同样的RARα基因发生融合，表达为PLZF-RARα融合蛋白^［2］。在APL发病机制中，应注意此两种融合蛋白分别与野生型PML或PLZF、RARα蛋白共存于APL细胞中。研究表明，PML-RARα或PLZF-RARα融合蛋白可显性失活（dominant negative）野生型PML或PLZF蛋白的功能和干扰正常RARα信号传导，因而研究融合蛋白如何影响PML蛋白正常功能及RARα信号传递成为理解APL发病及诱导分化机制的关键。

　　1　PML蛋白的正常功能及融合蛋白对PML蛋白功能的影响　早期体外转染实验表明，PML具有增殖抑制活性^［3］。Wang等^［4］以敲除（knockout）PML基因小鼠作为体内研究模型，发现纯合缺失PML鼠(缺失两个PML基因)有如下特征：①外周血成熟粒细胞（中性、嗜酸、嗜碱、单核）显著低于正常鼠；骨髓、肝、脾、淋巴结成熟粒细胞显著减少；②小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embyonic fibroblast, MEF)增殖率和³H-TdR掺入率显著高于正常鼠，而杂合缺失(仅缺失一个PML基因)PML鼠居中；③MEF克隆形成能力增强，S期细胞显著增多，G₀或G₁期细胞显著减少；④在诱变剂DMBA和TPA作用下，纯合缺失PML鼠皮肤发生更多的乳头状瘤。研究表明，PML蛋白抑制增殖的机制是通过阻滞细胞周期实现的。将PML基因转染乳腺癌细胞，Le等^［5］发现cyclin D1、CDK2表达显著下调，P53、P21^WAF1/CIP1表达上升，Rb蛋白去磷酸化，导致细胞阻滞在G₁期。Wang等^［4］进一步发现维甲酸(RA)信号通路可能需要PML蛋白的增殖抑制活性。在甲基纤维素培养体系中，正常鼠的造血前体细胞形成红系、髓系集落的数量在加入RA后明显增加，但纯合缺失PML鼠则无此效应。同时，作者发现1 μmol/L RA可诱导正常MEF细胞表达P21^WAF1/CIP1，而缺失PML的MEF细胞则无，说明PML介导RA依赖的P21^WAF1/CIP1表达。由于P21^WAF1/CIP1能诱导造血细胞分化^［6］，因而PML的功能缺失可解释APL情况下的分化阻滞。上述结果表明，PML蛋白至少部分地参与RARα/RXR信号传递。

　　PML蛋白的功能发挥与它在细胞内的定位密切相关。在正常细胞，PML蛋白以不连续点状方式（speckled pattern，punctate pattern）分布在细胞核内，电镜下呈0.3～0.5 μm直径，且与核基质相关的致密圈饼样结构结合称为核体（Nuclear bodies, NB）或POD（PML Oncogenic Domain）结构，正常细胞核约含10～30个^［7］。POD结构实质上为多蛋白复合体，除PML蛋白外，尚含SUMO-1^［8］、pRb^［9］、SP100^［10］、rfp^［11］、NDP55、ISG-20等蛋白成分。其中一些是自身免疫性疾病如原发性胆汁性肝硬化患者的核抗原^［7］。应用酵母双杂交系统，最近发现POD结构的另一个新成员是SUMO-1（Small 1 Ubiquitin-Mediated Protein）^［8］。SUMO-1属泛素相关蛋白Sentrin家族成员。实验证明SUMO-1参与PML基因的翻译后修饰过程，并因此介导PML蛋白的细胞内定位^［8,12］,主要依据有：①在表达PML蛋白的Hela细胞和COS细胞，免疫沉淀试验发现SUMO-1与PML蛋白形成共价复合物，该结合是可逆的，且依赖磷酸化发生；②采用免疫荧光双标记发现几乎所有POD结构内均含有SUMO-1蛋白和PML蛋白；③在非APL细胞，未经SUMO-1修饰的PML蛋白弥散分布于核基质中，而被SUMO-1修饰的则定位于POD结构。用As₂O₃处理PML细胞4小时后弥散性荧光完全消失，代之以POD结构增多、扩大，提示As₂O₃能使弥散性分布的SUMO-1和PML共定位于POD结构中^［8］。NB4细胞（含PML-RARα）经RA和As₂O₃各处理24小时、2小时后，Western blotting显示PML-RARα融合蛋白完全降解， POD结构的正常定位分别于24～48小时、3～6小时完全恢复，该时相特点提示：RA和As₂O₃通过降解PML-RARα释放被“扣押”的PML，继而被SUMO-1修饰再回到POD结构中。值得注意的是，PML-RARα也能与SUMO-1形成复合物，但与PML不同，SUMO-1化的PML-RARα被迅速降解，降解机制不清^［8］。Kamitani等^［12］认为，PML-RARα（长型、短型）均不能被SUMO-1修饰，因而不参与PML-RARα的降解。最近，利用减数文库技术，我们发现在NB4细胞中SUMO-1可被1 μmol/L RA上调，支持SUMO-1参与PML-RARα降解及POD结构恢复这一推测。目前，尚不清楚As₂O₃是否调控SUMO-1表达。

　　POD结构中另一重要成员是低磷酸化的pRb蛋白，是第一个被认识的肿瘤抑制基因，通过“扣押”一组E2F转录因子而控制细胞周期G₁-S转换。pRb亚细胞定位类似于PML，即呈弥散和颗粒状（POD样结构）分布，这一特点促使Alcalay等^［10］研究二者的可能结构和功能联系。应用免疫沉淀及免疫双重荧光叠加(Superimposition)实验，他们发现：①在体外，PML与pRb形成复合物，出现共沉淀；②以野生型pRb和PML基因转染U937细胞，80%以上含PML的POD结构与pRb定位在同一部位，而pRb家族其他成员（如P107、P103）则无此现象；③在NB4细胞，尽管POD结构解体，但PML／pRb仍共同定位于APL细胞特有的异常微颗粒样（microspeckles）结构中。进一步使用不同的缺失突变体，发现pRb“袋区”（pocket region）中703～737氨基酸为结合所必需（该区也是E2F转录因子的结合部位），而PML中多个结构域参与结合，其中N-末端B盒和C-末端为结合所必需，环指（ring finger）、Coiled-coil区进一步加强结合。由于PML-RARα也能有效地结合pRb，但缺乏不同长度的C-末端区，推测尚存在其他结合方式。功能上PML-RARα可能通过影响pRb定位，干扰其增殖抑制功能而参与APL发生。

　　最近发现，Sp100的另一个选择性剪接成分Sp100-HMG也定位于POD结构内，Sp100是最早发现的POD结构成员，而Sp100-HMG具有非序列特异的DNA结合能力，在被共转染的Hela细胞，Sp100、Sp100-HMG具有转录抑制活性，提示POD结构参与染色质水平上的转录调控^［9］。

　　上述结果表明，作为功能性多蛋白复合体，POD结构通过“扣留”多种重要的胞内调节蛋白而影响细胞基本的病理生理过程。不仅在APL，多种DNA病毒如单纯疱疹病毒Ⅰ型、腺病毒E4等也影响POD结构分布，用抗病毒药物干扰素处理后，PML的表达及POD数量、大小增加^［13］。Muller等^［8］认为正常细胞内两种形式的PML定位（弥散型和POD结构）存在动态平衡，POD结构可能是PML以及其他重要功能蛋白的贮存形式，在PML-RARα以及病毒感染等因素影响下，POD结构解体，其内容物释放，引起异常的细胞病理过程。

　　2　PML-RARα对RARα/RXR信号传导的影响　核激素受体RARα是配体依赖性的转录激活因子。正常情况下，RARα功能的最佳发挥有赖于与另一类维甲酸受体RXR 形成异二聚体。在RA（配体）缺乏时，RARα/RXR异二聚体的转录静默效应通过与一组辅助抑制因子（corepressors）,如SMRT(silencing mediator for retinoid and thyroid-hormone receptors)、N-coR(nuclear receptor corepressor)、mSin3形成复合物，再募集(recruit)组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)，后者使核小体组蛋白 (H2,H3,H4) 氨基-末端赖氨酸残基去乙酰化而带正电，并与带负电的DNA 结合，保持染色体的致密卷曲结构从而抑制转录^［14-16］。在生理浓度（10^-8mol/L）RA存在时，RA与RARα上配体结合区（E区）结合，导致构象改变，N-coR复合物从RARα上解离,进而募集辅助激活因子（coactivators）复合物，包括CBP/P300、P/CAF、NcoA-1/SRC-1、P/CIP等^［15］。其中CBP/P300和P/CAF具有强烈的组蛋白乙酰化酶活性，乙酰化组蛋白赖氨酸残基使之带负电而与DNA相斥，染色质结构舒展而激活转录^［17］。

　　在APL细胞，PML-RARα或PLZF-RARα均能通过形成同二聚体或分别与RXR形成异二聚体结合在维甲酸反应元件(RARE)上，干扰RARα/RXR信号传导。 临床上，凡具有PML-RARα蛋白的APL细胞只对药理浓度RA（10^-6～10^-7mol/L）起反应，而具有PLZF-RARα的APL细胞反应很差^［18］，提示RARα、PML-RARα、PLZF-RARα三者发挥转录功能对RA浓度的依赖性不同，依次为PLZF-RARα＞PML-RARα＞RARα。由于三者具有相似的RA结合能力^［19］，推测这一差别的原因跟它们与辅助抑制因子结合特性不同有关。应用细胞转染和免疫沉淀实验，几组作者^［20-23］同时发现，生理浓度的RA（10^-9～10^-8mol/L）使RARα结合的N-coR解离，但不影响PML-RARα/N-coR复合物稳定性。药理浓度RA（10^-7～2×10^-5mol/L）可使PML-RARα/N-coR完全解离，但即使在最高浓度RA（2×10^-5mol/L）作用下，仍有30% PLZF-RARα/N-coR复合物存在。进一步发现，与PML不同，PLZF能与N-coR形成复合物，即PLZF-RARα中有两个N-coR结合位点，分别位于PLZF和RARα上；而PML-RARα中，仅有一个位于RARα上。由于各自与N-coR亲和力不同，构成它们对RA反应性不同的基础：即RARα最弱，生理浓度RA使之解离；PML-RARα次之，药理浓度才能使之解离；PLZF-RARα最强，药理浓度仅能使之部分解离或者不解离。亲和力增高的原因，除N-coR结合位点增加外，也可能与PML或PLZF对RARα的构象效应有关。此外，另一辅助抑制因子SMART也有类似的结合动力学特征^［24］。结构上，RARα上的N-coR结合位点位于E区N-末端，称为CoR-Box；PLZF上的CoR-Box位于N-末端BTB/POZ区，而N-coR上2158～2239氨基酸序列最有利于结合PLZF。我们知道具有POZ结构的另一转录因子bcl-6也通过BTB/POZ与辅助抑制因子结合，提示核激素受体、含POZ锌指蛋白通过辅助抑制因子调控转录是一个普遍机制^［20］。

　　辅助抑制因子N-coR/SMART/mSin3复合物通过募集组蛋白去乙酰化酶抑制转录这一现象，进一步被HDAC抑制剂Trichostain和丁酸钠(sodium butyrate, NaB)效应所证实。50 nmol/L TSA能部分（50%）解除PLZF-RARα/N-coR的转录抑制效应，并诱导PLZF-RARα转染的U937细胞分化; 200 nmol/L TSA能部分恢复RA诱导NB4-R(RA抵抗细胞株)细胞的分化。由于是部分解除，提示除HDAC外，尚有其他因子参与转录抑制^［21］。此外，PML-RARα中RARα上的CoR-Box若发生突变，丧失N-coR结合能力，也可解除PML-RARα的分化阻滞效应^［22］。

　　不同转录因子的信号途径可通过利用共同的辅助抑制因子或辅助激活因子而相互关联。如CBP(CREB-binding protein)不仅作为RAR的辅助激活因子，也为CREB、AP-1、Stat-1等转录因子所必需^［25,26］，因而RARα途径的激活可能干扰CREB、AP-1、Stat-1等依赖的转录途径，相应地抑制cAMP、Ras、IFN-γ等信号路径^［20］。同样，Mad/Max异二聚体对靶基因的转录抑制也需要N-coR/ mSin/ HDAC，因而PML-RARα可通过竞争性利用N-coR/ mSin/ HDAC复合物而抑制Mad/Max信号途径^［27］。

　　3　结语　日益增多的证据表明，PML/PLZF-RARα对POD结构及RARα信号传导的干扰是APL发病机制的重要基础。从APL细胞POD结构在RA和砷剂应用前后的分布及其内容物之间相互关系的改变来看，可见POD结构在维持细胞增殖、分化、凋亡平衡中起着重要作用。 很多DNA病毒感染也与POD结构改变密切相关，干扰素处理使POD数量、大小增加。目前尚不能理解这些复杂现象背后有无共同本质。辅助抑制因子的介入能很好解释融合蛋白对靶基因的转录调控特性，但PML-RARα/PLZF-RARα对N-coR亲和力的不同可能不是唯一解释RA反应性不同的基础。PML-RARα中E区点突变可能介导APL对RA发生耐药^［28］；RARα-PLZF依靠PLZF的7个锌指而具有转录调节活性，这也可能成为对RA耐药的重要机制^［29］。进一步明确在APL发病机制中哪些基因被抑制，换句话说，哪些基因能被RA直接开启而使APL细胞分化，将成为下一步工作的重点。

　　作者单位：200025　上海第二医科大学附属瑞金医院

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收稿：1998-09-24　修回：1999-06-03