α－双炔失碳酯诱导人早幼粒白血病HL－60细胞分化

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第10期

楼丽君　胥彬

　　摘　要　目的：研究α－双炔失碳酯(α－anordrin，ANO)对人早幼粒细胞白血病HL－60细胞的分化诱导作用。方法：细胞生长用台盼蓝排染法；细胞分化根据细胞形态，酸性磷酸酶活性来决定；细胞周期变化用流式细胞光度术；细胞特异性抗原的表达用免疫细胞化学方法。结果：HL－60细胞经ANO(2～8μmol/L)处理96小时后，细胞生长受到明显抑制，抑制率达90％。同时，细胞核缩小，核浆比例增大，酸性磷酸酶活性呈剂量依赖性地升高，提示细胞向粒－巨细胞系分化。流式细胞仪检测发现ANO处理使G1期细胞比例增加。细胞免疫化学分析则表明ANO处理使PCNA表达下降，雌激素受体表达升高，而对c－myc表达没有影响。结论：以上结果说明ANO能够诱导HL－60细胞分化，这一作用可能与其通过雌激素受体，阻滞细胞周期进展，抑制PCNA表达有关。

　　关键词：α－双炔失碳酯　增生细胞核抗原　雌激素受体　细胞分化

　　在体外模型上，能够诱导肿瘤细胞终末分化的药物很多，如维甲酸类化合物，1，25－二羟维生素D₃，干扰素，佛波酯，平面极性化合物，细胞毒药物，环AMP调节剂及类似物等^[1,2]，但真正能够应用于临床并产生良好疗效的，目前只有全反式维甲酸(ATRA)。ATRA也有局限性，如只对急性早幼粒细胞白血病有效，对其它肿瘤无效；长期应用，容易产生抗药性等，因此，寻找新的分化诱导剂仍有十分重要的意义。

　　α－双炔失碳酯(α－anordrin，ANO)是我国自行研制、开发的避孕药物，我们实验室发现ANO能够阻滞细胞周期进展，抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，增效5－FU，放线菌素D，长春新碱的疗效，对体内、外多种肿瘤模型有效^[3～5]。本文研究了ANO对人早幼粒细胞白血病HL－60细胞分化的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1　药物和试剂

　　双炔失碳酯购自上海第十九制药厂，含α和β异构体，α异构体由本所植化室从中分离，纯化^[6]。α－双炔失碳酯(ANO)用无水乙醇溶解，临用前稀释，培养基中乙醇终浓度不高于0.1％，在此浓度下，乙醇对细胞生长不产生明显影响。ATRA，磷酸对硝基苯，购自Sigma公司。ATRA用无水乙醇溶解，临用前稀释。小鼠抗PCNA(proliferating cellnuclear antigen)单克隆抗体(M0879)为DAKO公司产品。小鼠抗人雌激素受体(ER)单克隆抗体购自华美生物工程公司。

　　1.2　细胞培养和药物处理

　　收集对数生长的细胞，调细胞数为1×10⁸/L^－1，用ANO或ATRA处理96小时后，观察细胞分化情况。实验重复两次。

　　1.3　生长曲线测定

　　0，24，48，72，96小时取少量细胞悬液计数，用台盼蓝染料排除法。

　　1.4　形态学观察

　　药物处理后，将细胞离心，涂片，Wright染色，油镜下观察形态变化。

　　1.5　酸性磷酸酶活性测定

　　收集细胞，悬浮于40μl蒸馏水中，超声粉碎2分钟，然后加入0.4ml 38mmol/L的柠檬酸缓冲液(pH4.8含0.1％TritonX－100，4.2mmol/Lρ－磷酸对硝基苯)，37℃下，温育15分钟，加入0.8ml1mol/LNaOH终止反应。在410nm波长处测OD值标准由线用对硝基苯制作，酸性磷酸酶活力以μg/10⁵细胞/分表示。

　　1.6　DNA含量分析

　　参照Gong等人的方法^[7]略加改进。即细胞用PI代替DAPI进行染色单因素分析。每个样本用FACStarplus流式细胞仪检测8000个细胞，根据DNA含量频率分布直方图计算各时相细胞百分比。

　　1.7　免疫细胞化学染色

　　细胞涂片，用丙酮固定，单抗的稀释度参照试剂盒说明，作不同浓度稀释，然后确定一最高信/噪比的稀释度。空白对照不加单抗。

　　2　结果

　　2.1　细胞生长

　　从图1可以看出，ANO明显抑制HL－60细胞生长，呈浓度和时间依赖性。当ANO浓度8μmol/L时，抑制率高达90％，IC₅₀约为5.2μmol/L。对照药物ATRA对HL－60细胞生长也有抑制作用，IC₅₀约为5.2μmol/L。

图1ANO(2～8μmol/L)对HL－60细胞生长影响的浓度和时间依赖性n=3,X±s＊＊与对照比较P＜0.01＜P＞

　　2.2　细胞形态

　　未经药物处理的HL－60细胞呈圆形或椭圆形，胞核大而圆，核浆比例较大，经ANO2μmol/L(＜IC10)处理后，核浆比例减小，核仁减少或消失，胞核呈肾形或有较大切迹(图2)，提示细胞向成熟表型分化。同样条件下，ATRA1μmol/L(＜IC10)处理4天，也能够诱导HL－60细胞分化(图2)。

图2ANO对HL－60细胞形态的影响A：对照；B：ANO2μmol/L；

　　c：ATRA1μmol/LWright′s染色×1000

　　2.3　酸性磷酸酶活性

　　酸性磷酸酶是巨噬细胞的标记酶之一，其含量的高低可反映细胞的成熟程度。ANO(2～8μmol/L)作用96小时，ANO剂量依赖性地使HL－60细胞的酸性磷酸酶活性升高(图3)。

图3ANO(2～8μmol/L)作用96小时对HL－60细胞酸性磷酸酶活性的影响n=3,X±s＊＊与对照比较P＜0.01

　　2.4　细胞周期分析

　　未加药物处理的HL－60细胞，细胞主要分布在S期，占52％；其次分布在G₁期，占42％；只有少部分细胞分布在G₂/M期，占6％。经ANO(2～8μmol/L)处理后，G₁期细胞呈剂量依赖性的上升，而S期细胞相应地减少。当ANO为8μmol/L时，G₁期细胞从42％上升到63％(P＜0.01)，而S期细胞则从52％减少到32％。ANO对G₂/M期的细胞分布影响较少。ATRA也有相似的作用，但对G₁期细胞的阻滞作用比ANO强。

　　2.5　免疫细胞化学检测

　　PCNA表达程度与细胞增生密切相关。PCNA表达较高的细胞，往往增生较快。相反，细胞增生较慢，并且趋向于分化，对照的HL－60细胞PCNA阳性率高达40％，ANO(2μmol/L，96小时)处理后下降到8％。考虑到ANO引起的PCNA表达下降有可能是非特异性细胞抑制作用所致，本文进一步观察了ANO对HL－60细胞c－myc的影响，发现ANO处理并不能使c－myc蛋白的表达水平发生明显改变。结果提示ANO抑制PCNA表达具有一定的特异性(图4A，B)。

图4ANO处理96小时对PCNA(A,B)和ER(C，D)表达的影响

　　a，C:对照；B，D：ANO2μmol/L×400

　　以前研究表明ANO具有一定程度的雌激素拮抗作用。因此，本文研究了ANO对HL－60细胞ER表达的影响。未经处理的HL－60细胞ER主要分布于胞浆，经ANO2～8μmol/L处理96小时后，HL－60细胞胞浆、胞核的ER免疫染色均增强，表明ANO处理不但使HL－60细胞的ER表达，并且使ER出现核转位。ER核转位是ER活化的标志之一，提示ER可能在ANO诱导HL－60分化中起重要的作用(图4C、D)。合用ER激动剂雌二醇，不但消除ANO对ER表达的上调作用，而且明显抑制ANO诱导HL－60细胞分化。进一步证实了ER是ANO诱导HL－60细胞分化的重要介导成分。

　　3　讨论

　　本实验表明ANO(2～8μmol/L)能够抑制早幼粒细胞白血病HL－60细胞生长，同时伴随细胞的酸性磷酸酶活性也升高，形态上向成熟细胞方向改变，说明ANO确实能够诱导HL－60细胞分化。结合细胞形态和酸性磷酸酶活性的变化，提示细胞向单核－巨噬细胞系列分化。

　　维甲酸类化合物的作用机制是与细胞内的相应受体结合，通过影响基因转录而产生作用。与维甲类化合物相结合的受体属甾体/甲状腺激素受体超家属成员。ANO属于甾体类药物，其作用机制可能类似于维甲酸，即通过作用甾体受体而发挥其分化诱导作用。本实验结果ANO处理引起ER上调和HL－60细胞分化。而二者可被ER拮抗剂雌二醇所阻断，说明ER在ANO诱导HL－60细胞分化中起重要作用。至于ANO上调ER，可能是细胞在受体拮抗剂作用后，代偿性上调的结果，就象ER激动剂雌二醇下调ER一样^[8]。

　　细胞在分化以前往往表现为生长阻滞，分裂能力下降，因此，分化诱导剂大多能抑制细胞生长。在分子水平即表现为与DNA复制及增生密切相关的基因表达减少，如PCNA、c－myc，c－myb等^[9～11]。ANO处理确实能够抑制PCNA表达。PCNA是参与DNA复制和修复的重要成分，是DNA聚合酶δ的辅助因子。PCNA表达减少，将使细胞增生停止，DNA修复能力下降。ANO导致细胞生长抑制，细胞周期阻滞(G1细胞比例升高)，可能与此药下调PCNA有关。有趣的是，本文并未观察到ANO在诱导HL－60细胞分化时，抑制c－myc的表达。这可能是所用方法不同所致。

　　以上结果表明ANO(2～8μmol/L)能够抑制肿瘤细胞生长，诱导HL－60细胞向单核－巨噬细胞系列分化，其作用可能是通过ER介导，抑制PCNA表达，阻滞细胞周期进展所致。

　　作者单位：楼丽君　衢州市人民医院(浙江省衢州市324000)

　　胥 彬　中国科学院上海药物研究所

参考文献

　　1 韩锐.肿瘤化学预防和药物治疗.北京:北京医科大学协和医科大学联合出版社,1993:219～40

　　2 Verstuyf A， Mathieu C,Verlinden L,et al. Defferentiation induction of human leukemia cells (HL60)by a combination of 1,25－ dihydroxyvitamin D3 and retinoic acid (all trans or 9－ cis). J Steroid Biochem Mol Biol,1995;53:431～ 41

　　3 Lou LG,Xu B. Induction of apoptosis in human leukemia cells by α － anordrin. Chin J Cancer Res,1997;9:1～ 5

　　4 Lou LG,Xu B.α － anordrin－ induced apoptosis of leukemia K562 cells is not prevented by cycloheximide. Acta Pharmacol Sin,1997;18(2):169～ 72

　　5 胥彬,周佩琴,俞伟娟.双炔失碳酯的抗实验肿瘤作用研究.肿瘤,1989;9(5):197～9

　　6 刘淑卿,朱大元,高清勇,等.双炔失碳酯差向异构体的分离和定量分析.生殖与避孕,1987;7(3):36～8

　　7 Gong J,Li X,Darzynkiewicz Z. Different patterns of apoptosis of HL－ 60 cells induced by cycloheximide and camptothecin. J Cell Physiol,1993;157:263～ 70

　　8 Gierthy JF,Spink BC,Figge HL,et al. Effects of 2,3,7,8－ tetra－ chlorodibenzo－ ρ － dioxin,12－ O－ tetradecanoylphorbol－ 13－ acetate and 17β － estradiol on estrogen receptor regulation in MCF－ 7 human breast cancer cells. J Cell Biochem,1996;60:173～ 84

　　9 Borden EC,Lotan R,Levens D,et al. Differentiation therapy of cancer:laboratory and clinical investigations. Cancer Res,1993;53:4109～ 15

　　10 Filmus J,Buick RN. Relationship of c－ myc expression to differentiation and proliferation of HL－ 60 cells. Cancer Res,1985;45:822～ 5

　　11 Sendler A,Kaffenberger W,Nuyken I,et al. Proliferation kinetics and PCNA expression of HL－ 60 cells following ionizing irradiation and granulocytic differentiation. Cell Prolif,1993;26:531～ 43