白血病疫苗的研制和应用<

　　CSCO2000年第四届学术年会

　　张王刚 何爱丽 赵万鸿 马肖蓉 曹星梅 陈银侠 刘 捷王剑利 王一理 司履生

　　摘　要　目的 近年来肿瘤的特异性主动免疫治疗很受重视，某些疫苗治疗肿瘤取得了肯定的临床疗效，但迄今尚不清楚何种疫苗的作用最好。我们研制了以不完全福氏佐剂(IFA)为基础的三种疫苗，通过动物实验及临床试验治疗，研究这些疫苗在主动免疫治疗白血病中的作用。方法 1、三种疫苗的研制；即灭活白血病细胞疫苗；灭活白血病细胞加IFA疫苗；灭活细胞、IFA及细胞因子IL-2、GM-CSF疫苗。2、动物实验：分别应用上述三种疫苗预防及治疗FBL-3红白血病荷瘤小鼠，观察小鼠寿命、病理、细胞毒性T淋巴细胞、巨噬细胞活性、毒副作用等变化。3、白血病患者的治疗：单独应用自身白血病细胞及IFA、GM-CSF、IL-2等制成的疫苗每周一次，共4次皮下注射治疗白血病患者。结果 1、动物实验：应用灭活FBL-3白血病细胞、IFA及GM-CSF、IL-2制成的疫苗预防及治疗FBL-3白血病小鼠后，肿块生长速度明显减慢，生存期明显延长；荷瘤小鼠抗FBL-3的细胞毒性T淋巴细胞活性明显增强；巨噬细胞杀伤活性亦增强。病理可见肿瘤组织坏死及单个核细胞为主的炎细胞浸润；疫苗注射部位有以单个核细胞为主的炎细胞浸润；肝、肾、心等脏器无明显异常。表明此疫苗有效安全、经济、制作及使用方便。2、白血病患者的治疗：应用此疫苗治疗40例化疗无效的急性白血病患者，取得肯定疗效，其中5例表达共刺激分子B7-1的增殖速度较慢的急性单核细胞白血病患者4例有效（2例CR、2例PR），经每半年一次疫苗加强治疗，2例患者存活3年多。另一例M4患者经疫苗治疗后单核细胞完全消失，但对其原始粒细胞无效。增殖速度快的白血病患者的疗效不佳。治疗中仅见6例患者全身低热，34例患者接种部位出现红肿硬结，其中4例患者硬结破溃，但未继发感染。结论 我们的结果表明：以IL-2、GM-CSF、白血病细胞及不完全福氏佐剂制成的疫苗在体内能增强特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤白血病细胞作用，有效的杀伤白血病细胞；特别适用于化疗无效或不能耐受化疗的增殖速度较慢的白血病患者的治疗，具有疗效肯定，且经济简便、无明显毒副作用的优点，值得进一步研究。

　　关键词：肿瘤的特异性主动免疫治疗；白血病疫苗

　　近年来肿瘤的特异性主动免疫治疗很受重视，某些疫苗治疗肿瘤取得了肯定的临床疗效，但迄今尚不清楚何种疫苗的作用最好。我们研制了以不完全福氏佐剂（IFA）为基础的三种疫苗，通过动物实验及临床试验治疗，观察了这些疫苗在主动免疫治疗白血病中的作用。

　　材料和方法

　　1 白血病疫苗的制备2

　　2.1 动物实验用疫苗的制备2.2

　　取对数生长良好的小鼠红白血病细胞株FBL-3细胞，加入丝裂霉素C，使其终浓度为20ng/ml，37℃水浴30分钟后，以2000转/分离心5分钟，弃上清液，用PBS洗涤两遍，调细胞计数为1×106/ml于PBS中。再制成三种疫苗；即灭活细胞疫苗（A疫苗），灭活细胞加不完全福氏佐剂疫苗（B疫苗），灭活细胞、不完全福氏佐剂及细胞因子IL-2、GM-CSF疫苗（C疫苗）。

　　2.3 白血病患者用疫苗的制备2.4

　　取富含白血病的细胞的患者骨髓15ml，肝素抗凝，应用淋巴细胞分离液分离出骨髓单个核细胞，经丝裂霉素处理后，加入含基因工程生产的GM-GSF、IL-2等的不完全福氏佐剂中，制成新型白血病疫苗。

　　3 白血病鼠的主动免疫治疗

　　3.1 荷瘤小鼠模型的建立

　　取生长良好的FBL-3细胞，以2000转/分离心5分钟，弃上清，以磷酸盐缓冲液洗两次，用台盼蓝排斥法计算活细胞数。每只C57BL/6小鼠左侧胁肋部皮下注射2×105个FBL-3，于3-7天触及肿块后，随机分组。

　　3.2 动物分组及免疫治疗程序

　　疫苗预防作用研究：分四组，每组8只正常鼠，分别用PBS，A、B、C疫苗第一天于左侧胁肋部皮下注射0.2ml，两周后，用野生型2×105个FBL-3细胞皮下攻击。攻击后第2周观察每组成瘤率，且处死4只小鼠用MTT比色法测其CTL及Mφ杀伤活性，并取其肿瘤局部皮肤、心肝、肾肺观察其病理学改变。

　　主动免疫治疗：分4组，每组8只荷瘤小鼠，于成瘤后的第7天分别用PBS及A、B、C三种疫苗左侧胁肋部皮下注射0.2ml，每周一次，共4次，于第5周观察各组肿瘤消退率，并处死4只小鼠，取其肿瘤局部皮肤，疫苗注射部位皮肤，心肝、肾、肺作病理学观察，并用MTT比色法测其Mφ及CTL杀伤活性。

　　4 白血病患者的疫苗治疗

　　4.1 病例：急性白血病患者共40例，4.2 其中6例为急性淋巴细胞白血病（ALL），4.3 3例为慢性粒细胞急粒变，4.4 余31例均为急性非淋巴细胞白血病，4.5 其中M1 2例，4.6 M2 3例M3 2例，4.7 M4 5例，4.8 M5 19例，4.9 M5 中2例由MDS-RAEB转化而4.10 来。病例中男23例，4.11 女17例，4.12 年龄6~71岁，4.13 均为我科1995年7月至2000年8月住院患者，4.14 多数患者经两个疗程的HA或DA方案化疗不4.15 能缓解或低增生性白血病经小量化疗不4.16 能耐受者。

　　4.17 主动免疫治疗程序

　　所有接受此治疗的患者在停用化疗两周后检查骨髓并开始单独接种疫苗，每次取含白血病细胞108个的疫苗1.6ml，分两点前臂皮下注射，每隔7天重复一次，共4次，免疫治疗结束后复查骨髓，并不再化疗及中药等治疗。随访中如白血病复发时，改用其它治疗；如能维持缓解至6个月，则加强注射此疫苗一次。

　　4.18 疗效判断及毒副作用观察

　　完全缓解（CR）、部分缓解（PR）及无效（NR）的标准同常规标准，增加微效（MR）标准，即疫苗治疗后外周血的白血病细胞数较前明显减少，但仍大于20%。观察治疗前后体温、血象、骨髓象、肝肾功、心电图及局部反应等。

　　4.19 B7及MHC检测

　　应用间接免疫荧光法分别观察患者白血病细胞MHCI、II类分子，单抗购自中国科学院血液学研究所。应用直接免疫荧光法检测共刺激分子B7-1（CD80）、单抗购自Pharmingen公司。

　　结 果

　　1 动物实验部分

　　1.1 成瘤性： 共有52只C57BL/6小鼠注入FBL-3细胞，1.2 有49只小鼠在3~7天后可触及肿瘤，1.3 成瘤率94.23%，1.4 所有成瘤小鼠随机分组，1.5 每组8只，1.6 用作治疗组。

　　1.7 疫苗的预防作用观察

　　先应用PBS、A、B、C疫苗预防接种C57BL/6小鼠，再接种FBL-3白血病细胞，成瘤率分别为100%，87.5%、62.5%、37.5%，C疫苗与PBS组相比，有显著性差异，P＜0.05，说明由灭活的FBL-3作抗原，含IL-2、GM-CSF的疫苗可有效的保护C57BL/3小鼠免受FBL-3细胞的攻击。见附表1

表1 各预防组小鼠成瘤情况

　　1.8 疫苗的治疗作用观察

　　四组荷瘤小鼠应用PBS、A、B、C三种疫苗治疗4次后，中位生存时间PBS组为43.5天，A疫苗为44.5天，B疫为75天，而C疫苗为93.5天，表明以灭活细胞，IL-2、GM-CSF及不完全福氏佐剂制成的疫苗，对红白血病荷瘤小鼠皮下肿瘤生长的抑制作用最强，并显著延长小鼠的寿命。见附表2

表2 治疗组各组小鼠中位生存时间

　　1.9 主动免疫治疗后小鼠Mφ杀伤活性变化

　　小鼠荷瘤3周后的Mφ杀伤活性为8.95%，明显低于正常鼠的23.4%（P＜0.05），表明肿瘤在机体内的生长抑制了小鼠的非特异性细□庖吖δ堋Ｓ靡呙缰瘟?次后，荷瘤小鼠的Mφ杀伤活性有不同程度的提高，其中以C疫苗的提高作用最明显，达50.28%，而A疫苗为28.22%，B疫苗为 29.63%，P＜0.05。表明以细胞因子为主的疫苗可增强荷瘤小鼠的非特异性细胞免疫功能，见附表3。

表3 治疗4次后小鼠Mφ杀伤活性变化

　　1.10 免疫治疗后的CTL杀伤活性变化

　　荷瘤3周小鼠的CTL杀伤活性为4.55%，明显低于正常对照鼠的28.79%，应用疫苗治疗4次后，A疫苗组的CTL活性为36.88%，B疫苗组为42.85%，而C疫苗组为59.48%，表明灭活细胞+不完全福氏佐剂+细胞因子的疫苗可有效的激发机体的特异性主动免疫反应。见附表4。

　　1.11 疫苗治疗后的病理变化

　　在局部疫苗注射部位，仅见注射细胞因子为主的疫苗局部有炎细胞浸润，主要以单个核细胞为主；注射局部未见皮肤破溃；各治疗组小鼠的心、肝、肺及肾脏均未见异常病理改变，说明此三种瘤苗对脏器无明显毒副作用。

表4 治疗4次后小鼠CTL杀伤活性变化

　　2 白血病患者的疫苗治疗

　　2.1 缓解率

　　从表5可见，接受疫苗治疗的40例急性白血病患者中，所有患者均完成了4次疫苗注射，免疫治疗的总有效率达40%，有效患者血象好转时间多在应用疫苗接种两次后，表现为白血病细胞数量逐渐减少，血小板，血红蛋白上升。在完成4次注射后骨髓及血象可逐渐达PR及CR，5例CR患者均为女性，4例M5，一例ALL。且5例患者治疗前骨髓多数增生低下或活跃，2例M4患者应用疫苗治疗后骨髓中单核细胞数量较治疗前明显减少，达CR，但粒细胞白血病数量增加，表明此疫苗对单核细胞白血病疗效较好。

表5 疫苗治疗40例白血病的疗效

　　2.2 缓解期及生存时间

　　本组5例CR患者，缓解后未接受任何治疗，定期检查血象、骨髓像，中位CR期7个月，其中2例在每6个月时接受一次疫苗强化接种，已分别持续缓解达36个月及30个月，而余3例未接受疫苗加强治疗者则分别于9个月、11个月、11个月复发，改用化疗后死亡。

　　MR患者多在短其内的白血病细胞又逐渐增多，改用其它治疗。4例疫苗治疗无效患者在改用化疗时对化疗较前敏感，容易达到CR。

　　2.3 毒副反应

　　34例接受疫苗治疗患者，接种部位出现红肿硬结，直径1-7cm大小不等，其中4例直径较大者发生破溃，经局部消毒后4个月左右愈合，无1例继发细菌感染。特别重要的是局部硬结较大者，疗效多较好，无硬结者一般疗效不佳。6例患者注射疫苗后全身低热，经用消炎痛后好转。余未见明显毒副反应，肝肾功心电图等治疗前后无明显变化。长期随访未见有自身免疫性溶血，血小板减少及白细胞减少者。

　　2.4 免疫治疗疗效与MHC、B7-1关系

　　5例疫苗治疗有效患者，治疗前其白血病细胞膜上的MHCI、II类分子及B7-1均阳性，无效病例虽MHCI、II类可阳性，但B7-1分子均不表达，表明白血病细胞表达B7-1者免疫治疗易有效。

　　讨 论

　　目前初诊的急性白血病患者约有 30%对化疗耐药，而复发患者大多数再化疗疗效不佳，这是急性白血病死亡的主要原因，迄今尚未见有克服化疗耐药的好方法。

　　人们曾对应用疫苗治疗白血病寄予厚望，但80年代用卡介苗及白血病细胞制成的疫苗主动免疫治疗急性的白血病疗效不明显[1]。近年来，随着分子免疫学的飞速发展，基因工程疫苗如转B7、、IL-2、GM-CSF等疫苗在治疗鼠白血病上取得较好疗效，但尚未见用于白血病患者治疗[2]。最近，Nestle 等应用树突状细胞与黑色素瘤细胞制成的疫苗治疗晚期黑色素瘤的有效率达40%[3]。而Rosenberg等应用不完全福氏佐剂加IL-2、GM-CSF制成的多肽抗原疫苗，治疗晚期黑色素瘤的有效率亦取得明显疗效[4]，但树突状细胞疫苗制备复杂。本文应用耐药的白血病细胞、不完全福氏佐剂及细胞因子IL-2、GM-CSF制成的此新型疫苗，主动免疫治疗40例化疗耐药或不能耐受化疗的急性白血病患者，取得与Resenberg等治疗黑色素瘤相似的疗效，目前尚未见有应用疫苗治疗急性白血病取得如此好疗效的报道。且此方法经济、制作应用简便，无明显毒副作用，既具有基因工程疫苗长效的优点，又能方便的加入其它具有抗白血病的细胞因子及CD28单抗等，有可能进一步提高疗效，值得深入研究。

　　目前认为肿瘤细胞逃避机体免疫监视的原因在于（1）缺乏具有免疫原性的特异性肿瘤抗原。（2）MHC分子表达不足或缺陷，（3）共刺激分子表达不足或缺陷，（4）肿瘤微环境抑制免疫功能；（5）树突状细胞功能减低。（6）T淋巴细胞功能缺陷，细胞因子水平异常等[5]。已证实许多血液恶性肿瘤具有不同类型的肿瘤抗原，如CML的融系鞍？cr-abl等；我们的工作表明白血病细胞多表达MHCI、II类分子，但多数不表达B7-1，仅部分单核白血病细胞表达B7-1，这可能是M5患者治疗有效的重要原因，另外，单核白血病细胞本身在疫苗作用下可能发挥树突状细胞的抗原递呈作用。一般认为不完全福氏佐剂产生Th2样作用，故抗肿瘤作用有限，而 GM-CSF是目前公认的较好佐剂之一，可产生Th1样作用。我们的动物实验也说明此点，单用不完全福氏佐剂制成的疫苗治疗鼠白血病作用弱，而再加入GM-CSF、IL-2后抗瘤作用明显加强，其机理可能与激活树突状细胞，增强抗原递呈，提高细胞毒性T淋巴细胞对白血病细胞的特异性杀伤能力有关。故在我们制备的此疫苗中，细胞因子可能起了重要作用，而不完全福氏佐剂在局部控制缓释，发挥了协同作用。

　　另外，本文结果表明此疫苗治疗部分高负荷白血病患者的疗效差， 主要对骨髓白血病细胞增殖较慢的女性M5患者具有明显疗效，除了与这些患者单核白血病细胞表达B7外，可能与这些患者肿瘤负荷较小，容易产生CTL有关，但为何主要是女性患者具有显著疗效尚不清楚。

　　应用此疫苗加强接种后2例患者能较长时间存活，表明此疫苗可使机体产生记忆性T淋巴细胞，再刺激后能发挥回忆反应，可能是此疫苗发挥长期疗效的基础。

　　本文应用此新型疫苗主动免疫治疗化疗耐药的急性白血病，部分患者取得较好疗效的结果表明，急性白血病患者的免疫缺陷，能够应用疫苗使之逆转，这具有重要的理论及临床应用价值，为今后深入研究急性白血病的主动免疫治疗提供一重要依据，但因多数患者的疗效不理想，有必要再改进此疫苗，以期提高主动免疫治疗的疗效。

　　作者单位：西安交通大学第二附属医院血液科(710004)

　　参考文献

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　　nestle FO, Aligugic S. Gilliet M, et al. Vaccination of melanoma patients with peptide-or tamur lysate-pulsed dendirtic cell. Nat Med 1998,4:328

　　rosenberg SA, Yang JC, Schroartzantruber DC, et al. Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptied vaccine for the treatment of patients with metastaic melanoma. Nat Med 1998;4:321

　　hirano N, Tokahashi T, Ohtakel S et al. Expression of costimulatory molecules in human leukemia. Leukemia 1996; 10: 1168

　　the Preparation and Application of Leukemic Vaccine

　　zhang Wanggnag, He AiLi , Zhao Wanghong, et al.

　　dept of heamatology, The second Affiliated Hospital of

　　xi'an Jisotong University, Xi'an 710004

　　objective: New attention has been given on the specitic active immunotherapy of tumor in recent years.some vaccine has taken definite clinical effect on tumor, howeuer it has been unclear that which vaccine is most effective so far. We have prepared 3 types of vaccines based on incomplete freund adjuvant (IFA) and have studied effect of these vaccines on leakemia active immunotherapy throngh animal experiment and clinical trial.

　　methods: 1. Preparation of 3 types of vaccines: That means inactive leukemic cell vaccine; inactive leukemic cell and IFA; inactive leukemic cell、IFA and cytokine IL-2、GM-CSF.

　　2. Animal experiment: 3 above-mentioned vaccines were inocul ated respectively to FBL-3 erythroleukemia bearing mice therapeutically and prophylatically. Life-span, pathology changes of etc, of mice were observed

　　3. Therapy of Leukemia patients: Every patient was injected subcutaneously with above-mentioned vaccines once a week for 4 weeks

　　iII Results: 1. Animal experiment: After the vaccine which comprise inactive FBL-3 leukenic cell IFA and IL-2, GM-CSF has been inoculated to FBL-3 erythroleukemia mice therapeutically and prophylatiocally, the tumor growth decreased obiously, life-span of the mice lengthened apparently, the activity of CTL of the mice with tumor burden agianst FBL-3 increased evidently, and the killing activity of macrophage also increased.

　　the necrosis of tumor tissue, the infiltration of mononuclear cells in both tumor and the site of injection and no abnormatity of organs such as liver, kidney and heart were observed in pathology, It showed that this vaccine was effetive、safe、economical and convenient in preparation and application.

　　2.Therapy of leukemia Patient: This vaccine has been incculated to 40 patients on whom the chemotherapy had failed to take effect, and definite effect was obtained. Efficacy was observed on 4 of 5 acwte monocytic leukenia (M5), whose leukemic cell membrane expressed costimulatory molecules B7-1 and whose leukemic cells proliferated slowly, (2 achicved CR and 2 achieved PR). 2 patiedts lived for more than 3 years by using this vaccine twice a year for enhancement therapy.

　　that monocytes disappeared completely bnt blast granulocytes didn't was stopped in another M4 patient. No good efficacy was obesrved on patient whose leukemica cells propliferated rapidly. Red swelling and induration appeared in the site of injection in 34 patients. 4 of which festered and no infection happened afterwards

　　iV Conclusion: Our results show the vaccine comprise leukemic cell IFA and IL-2 GM-CSF can enhance specific function of CTL against leukemic cell and can kill leukenic cell effectively in vivo. This vaccine is expecially suitable for the therapy of leukemia patients on whom chemotherapy had failed to take effect or who cann't endure chemotherapy with leukemic cells propliferating slowly.

　　this vaccine has economical and conventional advantages, with which detinite effect and no obvious side-effect It should be worth further studying.