PML/RARa融合基因检测在早幼粒细胞白血病鉴别诊断中的意义
临床血液学杂志 2000年第3期第13卷 研究报告
作者:汪健 孙自敏 何晓东 徐修才 吴竞生
单位:汪健 (安徽省立医院中心实验室 合肥,230001);孙自敏 (安徽省立医院中心实验室 合肥,230001);何晓东 (安徽省立医院中心实验室 合肥,230001);徐修才 (安徽省立医院中心实验室 合肥,230001);吴竞生 (安徽省立医院中心实验室 合肥,230001)
急性早幼粒细胞白血病(APL),具有特异性的染色体易位t(15∶17)及PML/RARa融合基因。在细胞遗传学(MIC)分型的基础上,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测APL的PML/RARa融合基因的mRNA,可以用来诊断或鉴别诊断,同时也可以进行微量残留白血病细胞(MRLC)的检测。
1 材料与方法
1.1 病例
例1、2为经外院诊断和治疗后转入我院的患者,例3~9为门诊或住院的患者,经FAB分型不能完全确诊,例10、11是同一例初诊与完全缓解26个月的M3患者,例12、13是同一例完全缓解8个月与32个月患者。13例次中,男4例,女9例,年龄17~68(中位年龄36.5)岁。
1.2 方法
细胞遗传学:将骨髓细胞24 h短期培养,常规裂解、预固定、固定、制片、烤片、G显带处理,分析20个以上中期分裂相,核型分析根据染色体国际命名法(ISCN 1985)。
免疫分型:所用单抗包括B淋巴系的CD10、CD19、CD22,T淋巴系的CD2、CD3、CD5、CD7,髓系的CD9、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33,造血干/祖细胞的CD34,以及组织相容性抗原HLA-DR。二抗为标记异硫氰酸荧光素(FITC)的兔抗鼠IgG。所有试剂均购自中国科学院天津血液病研究所。阳性判断标准:荧光阳性细胞>30%。
RNA提取:肝素抗凝的骨髓或外周血细胞,用淋巴细胞分离液分出单个核细胞,细胞洗涤计数后加入含10%DMSO保存液(100 ml/L小牛血清的IMDM),混匀后置-80 ℃冰箱保存,临用前取出,用TRIZOL RNA试剂盒提取。测定吸光度(A)值,并要求A260/A280>1.6。
筑巢式RT-PCR检测APL的PML/RARa mRNA 寡核苷酸引物由瑞金医院上海血液学研究所提供。
逆转录反应:40 μl体系中包括1 μg RNA,QRT 100 ng,RNAsin 40 U,200 U M-MLV,0.01 mmol DTT,20 mmol dNTP,37 ℃孵育1 h,4 ℃备用。
PCR反应:PCR反应分两个体系进行。第一体系检测L型,第一步PCR引物PCR1+PCR6,第二步PCR引物PCR2+PCR5;第二体系检测S型,第一步PCR引物PCR1+PCR3,第二步PCR引物PCR2+PCR4。反应体系100 μl,第一步反应包括逆转录产物10 μl,引物150 ng,20 mmol dNTP,Taq酶1.5 U;第二步扩增反应用10 μl第一步扩增产物进行扩增,4℃冰箱备用。
产物鉴定:10 μl PCR扩增产物,20 g/L琼脂糖电泳,溴乙啶染色,紫外灯观察结果。
2 结果
9例经形态学、免疫分型及MIC分型或者缺乏初诊资料不能完全确诊的患者中,5例PML/RARa融合基因阳性,另4例综合MIC分型结果与融合基因的结果,分别诊断为MDS、CML、M2、M2复发。APL长期完全缓解的例10患者PML/RARa融合基因消失。长期缓解的例12患者,虽然细胞遗传学未见异常,但PML/RARa融合基因仍然存在。结果见表1。
病例 |
形态学 |
免疫分型 |
细胞遗传学 |
基因分型 |
诊断 |
治疗 |
结果 |
1 |
M3? |
CD13、CD33 |
46,XY |
S |
M3 |
ATRA |
CR |
2 |
M3? |
… |
… |
L |
M3 |
ATRA |
CR |
3 |
M2/M3 |
… |
t(15;17) |
S |
M3 |
ATRA |
死亡 |
4 |
M3/M5 |
CD11b、CD15、
CD9、CD33 |
t(15;17) |
L |
M3 |
ATRA |
CR |
5 |
食道癌并发M3? |
… |
46,XY |
L |
M3 |
ATRA |
CR |
6 |
MDS/M3 |
CD2、CD15、CD33 |
46,XY |
… |
MDS |
化疗 |
失访 |
7 |
M3/CML |
… |
t(9;22) |
… |
CML |
羟基脲 |
CR |
8 |
M2/M3 |
CD13、CD33 |
46,XX |
… |
M2 |
化疗 |
CR |
9 |
M2转为M3? |
HLA-DR |
t(15;17) |
… |
M2复发 |
化疗 |
死亡 |
10 |
M3 |
… |
t(15;17) |
L |
M3 |
化疗 |
CR |
11 |
M3-CR |
… |
46,XX |
… |
M3-CR |
化疗 |
CR |
12 |
M3-CR |
… |
t(15;17)8/23 |
L |
M3-CR |
化疗 |
CR |
13 |
M3-CR |
… |
46,XX |
L |
M3-CR |
化疗 |
CR |
L:长型, S:短型; CR:完全缓解; ATRA:全反式维甲酸
3 讨论
骨髓细胞形态学迄今仍是白血病分型最基本的依据,但单纯形态学检测的诊断率只能达85%左右,特别是经过治疗后的患者,形态学则完全不能够确诊。由于髓系白血病细胞表达多种分化抗原,且与正常血细胞存在多种抗原的交叉表达,因此免疫分型不能特异识别白血病克隆,目前尚未发现有针对于白血病各亚型的特异标志,免疫分型对确诊早幼粒细胞白血病意义不大。细胞遗传学虽然有重要的鉴别诊断和预后意义,但由于受到细胞数以及化疗药物的影响,加之原红细胞正常分裂相掩盖等原因,使其受到一定的限制。
APL患者90%以上具有特异的t(15;17)(q21;q12-21)染色体易位。17号染色体维甲酸受体a(RARa)基因和15号染色体上的早幼粒细胞白血病基因(PML)发生交互易位。17号染色体断裂点恒定地位于RARa基因的一个17 kb的内含子2中,而15号染色体断裂点位于PML基因两个断裂点集中区域内,结果产生L和S两种不同长度的PML/RARa融合基因转录本,经RT-PCR扩增分别产生151 bp与163 bp大小的核苷酸片段。RT-PCR技术具有敏感度高、特异性好的特点,即使染色体分析无明显异常核型也能检出分子异常,特别是临床缓解的患者,细胞遗传学分析无异常,通过基因检测的方法,可以进行MRLC检测。因此通过APL融合基因PML/RARa mRNA检测,可以鉴别诊断难以确诊的病例以及MRLC的检测,以便临床选择可行的治疗方案、预后判断以及疗效观察。
收稿:1999-07-06