微波和长春新碱体外净化白血病细胞的研究

中华物理医学与康复杂志 1999年第3期第21卷 论著

作者：史泓浏　王晓怀　江悦华　杨太成　赖声礼　罗绍凯

单位：史泓浏、王晓怀、江悦华、杨太成　510010　广州军区广州总医院医学实验科；赖声礼　华南理工大学电子信息学院；罗绍凯　中山医科大学附属第一医院血液科

关键词：微波；长春新碱；白血病

　　【摘　要】　目的　研究一种较好的微波和长春新碱的联合方法,用于白血病细胞的体外净化。方法　将微波和长春新碱分别单独以及联合作用于正常骨髓细胞,HL60, U937和K562细胞株,通过GM-CFU和tCFU的测定来评价体外净化的效果。结果　微波和长春新碱对GM-CFU,tCFU存活率均表现出抑制作用,抑制程度呈现出功率相关性和浓度相关性;在一定范围内,微波和长春新碱对3种细胞株tCFU存活率的抑制显著大于GM-CFU(P＜0.05或P＜0.01);微波和长春新碱联合作用对3种细胞株的杀伤作用比单用长春新碱有显著性增加(P＜0.05),而不显著增加对GM-CFU的抑制(P＞0.05)。结论　微波和长春新碱联合用于白血病细胞的体外净化能产生协同效应,值得进一步研究。

Microwave and vincristine for purging leukemic cells in vitro

SHI Hongliu, WANG Xiaohuai,JIANG Yuehua,et al.

　　Department of Medical Research,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military District, Guangzhou 510010

　　【Abstract】　Objective　To study the method of microwave combined with vincristine for purging leukemic cells in vitro.Methods　Normal human bone marrow cell,HL60,U937 and K562 cell lines were treated by microwave and vincristine alone or by the combination of both. GM-CFU and tCFU were measured in order to evaluate the effect of purging in vitro.Results　Both microwave and vincristine showed an inhibitory effect on GM-CFU and tCFU,which depends on microwave power and vincristine's dose. To certain extent,the inhibition of 3 cell lines treated by microwave and vincristine were significantly higher than that of GM-CFU(P＜0.05 or P＜0.01).Compared with vincristine alone,the combination of microwave and vincristine showed a remarkable increase killing effect on 3 cell lines(P＜0.05),while with no significant increase on GM-CFU inhibition(P＞0.05).Conclusion　The combination of microwave and vincristine showed a synergistic effect on purging leukemic cells in vitro.

　　【Key words】　Microwave　　Vincristine　　Leukemia

　　自身骨髓移植(autologous bone marrow transplantation,ABMT)已被用来治疗某些种类的白血病,但移植物骨髓中残存的白血病细胞很容易导致复发。因此如何清除这些残存白血病细胞成了提高ABMT疗效的关键之一。各种净化手段层出不穷，但微波用于净化却极少见诸于报道。微波已在临床治疗中特别是肿瘤的治疗上发挥着作用^［1］,我们研究了微波和长春新碱(vincristine ,VCR)及两者联合对不同类型的白血病细胞进行体外杀伤,为临床应用提供依据。

　　1　材 料 和 方 法

　　1.1　标本制备

　　12例正常骨髓细胞取自正常献髓者及非恶性血液病患者。所采的骨髓细胞经淋巴细胞分离液(比重1.077)制成单个核细胞(MNC)悬液,将2×10⁹个/L 细胞置于含体积分数为10%的小牛血清RPMI-1640培养液中,备用。HL60细胞株,U937细胞株和K562细胞株分别作为急性早幼粒白血病(M3),急性单核白血病(M5)和红白血病(M6)的模型。这些细胞均用含体积分数为10%的小牛血清RPMI-1640培养液进行传代培养,待细胞处于对数生长期时用于实验。WL-100电脑微波治疗仪(上海沪通电子仪器厂生产)由本院骨科吴增晖博士提供;VCR每支1 mg,广州明兴制药厂出品。

　　1.2　实验处理

　　正常人骨髓和HL60,U937,K562细胞株均采用以下同等处理条件:①微波处理:将总体系1 ml含2×10⁵个的细胞悬液接种于24孔板中, 室温下(约25℃)静置片刻后给予微波辐射。根据预实验结果, 选择0.49、0.54、0.60、0.68和0.80 W/cm²共5种功率密度作用于细胞,作用时间为30 min,4℃下冷却片刻后加入培养体系继续培养或进行药物处理。对照组细胞置于室温下30 min,其余处理相同。实验中所测温度是微波作用结束时的培养液温度。②VCR处理:根据文献和预实验结果,选择4种浓度,在总体系1 ml中, 细胞(包括细胞株和MNC)为2×10⁵个/ml,药物质量浓度分别为0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L和0.5 mg/L,体积分数为10%的小牛血清,其余为培养液。药物和细胞在37 ℃体积分数为5%CO₂培养箱中温育1 h,每10 min轻轻摇匀1次,最后用培养液洗2次去除药物,重新将细胞悬液体积调至1 ml。对照组加入等量培养液,其他处理相同。③微波+VCR处理:选择0.54W/cm² 的微波功率密度作用于细胞30min后,立即进行②所述的药物处理。

　　1.3　培养体系

　　1.3.1　GM-CFU的培养体系:参照文献［2］完成,培养总体系1 ml,均含2×10⁵个MNC,体积分数为20%小牛血清,质量分数为10%伴刀豆球蛋白刺激的淋巴细胞培养上清(PHA-LCM),0.5%甲纤(sigma公司产品),青链霉素各100单位,加入24孔板中,置体积分数为5%CO₂ 37 ℃,饱和湿度下培养8 d,分别计数40个细胞以上的集落数。

　　1.3.2　 细胞株的培养体系:3种细胞株浓度均为2×10³个/ml,不加PHA-LCM,其余和GM-CFU培养方法相同。

　　1.4　细胞存活和形态学观察

　　细胞活力用台盘兰试验确定。细胞经瑞氏－吉姆萨染色后，光镜下观察。

　　1.5　统计学处理

　　实验数据以(±s)表示,采用χ²检验和t检验。集落存活率=试验组集落均数/对照组集落均数×100%。

　　2　结　　果

　　2.1　表1显示,随着微波辐射功率的增大,培养体系中培养液的温度升高,GM-CFU和tCFU存活率随之降低。但微波对GM-CFU存活率的影响小于tCFU存活率。3种细胞株中, HL60-tCFU受微波的抑制程度最大,U937-tCFU和K562-tCFU受微波的抑制相对弱些。微波功率为0.68 W/cm²时,HL60-tCFU,U937-tCFU,K562-tCFU的存活率分别为3.5%、13.6%和19.1%,均显著低于相同条件的GM-CFU存活率:47.8%(P＜0.01)。表明微波对白血病细胞有一定的选择性杀伤作用。

表1　微波对GM-CFU和tCFU存活率的作用(%,±s)

注:和相同条件下的GM-CFU相比*P＜0.05 ** P＜0.01

　　2.2　从表2可见,未加微波处理时,GM-CFU和tCFU存活率随VCR浓度的增加而减小,但VCR对tCFU的抑制作用大于GM-CFU。3种细胞株中,K562对VCR最不敏感,但当VCR达到0.5 mg/L时,K562-tCFU存活率降到13.2%,也显著低于相同条件下的GM-CFU存活率(55.3%)(P＜0.05)。

表2　微波和(或)VCR对GM-CFU和tCFU存活率的作用(%,±s)

注:tCFU和相同条件的GM-CFU相比*P＜0.05 **P＜0.01;VCR和VCR+微波相比#P＜0.05

　　微波和VCR联用后,对3种细胞株的杀伤作用较之于单用VCR有显著性增加(P＜0.05)而不显著增加对正常骨髓GM-CFU的抑制(P＞0.05)(0.5 mg/L的VCR除外)。当VCR达到0.5 mg/L时,和微波联用作用于细胞,3种细胞株的集落性生长均被完全抑制,而GM-CFU存活率仍达到13.8%;虽然13.8%的GM-CFU较低,仍可说明这种联合方法对正常造血细胞杀伤小而对各种白血病细胞杀伤大。

　　2.3　光镜下细胞经微波作用后均出现体积缩小、变圆、与周围细胞脱离、胞浆浓缩、核固缩等现象。当微波功率为0.54 W/cm²以下,即培养液温度在41℃时,死亡的细胞大多外形皱曲,但细胞形态尚属完整;随着微波功率增大,培养液温度升高,细胞破裂,胞浆外溢,细胞形态消失。

　　3　讨　　论

　　骨髓体外净化是有关ABMT研究的一个热点,在不断涌现的各种净化手段中,联合方法具有药物用量少,净化效率高,毒副作用小的优势而日益受到关注^［3］。我们将微波和VCR对白血病细胞的体外净化做一初步探讨。研究发现:① HL60,U937和K562相对于正常骨髓细胞对微波较为敏感。当微波功率提高到0.80 W/cm²时,3种细胞株的tCFU完全被抑制,而GM-CFU尚有13.4%存活。微波之所以能杀伤白血病细胞,很大程度是由于其特殊的热效应。即受微波照射的细胞中排列极其混乱的极性分子因趋向作用而发生振荡,相互磨擦而产生热量,随着温度上升造成细胞不同程度的损伤。这种热效应和通常的水浴或空气浴是不同的。本文未涉及其他形式的高温对白血病细胞的影响,无法将之同微波的净化作用进行比较。但郑华金等人^［4］的工作表明:微波比单纯高温对白血病细胞具有更强的选择性杀伤。微波对细胞的作用除了热效应外,还具有一定的非热效应^［5］,因此微波的热效应和非热效应都可能对白血病细胞具有选择性杀伤作用。② 微波和VCR在白血病细胞的体外净化中具有协同作用。从表2的数据可知,几乎每种浓度的VCR在微波的协助下对tCFU的抑制都显著大于相同浓度VCR对tCFU的抑制(P＜0.05)。K562对VCR的敏感度较差,0.1 mg/L的VCR使得K562-tCFU存活率仍有45.5%,而微波和0.1 mg/L的VCR联用却使其降为8.4%。这种微波所致的药物增敏作用的机理还不清楚,可能是微波的热效应改变了细胞膜的通透性,使得药物更容易进入细胞而发挥作用。李继华等^［6］在其综述中提到VCR是一种在热疗中有增敏作用的药物,这和本文结果是一致的。③ 微波联合VCR作用于不同类型的白血病细胞,其效果是不同的。对HL60的净化效果较好,对U937和K562的效果欠佳。提示对于不同类型的白血病患者,在ABMT时其体外骨髓净化应采用不同的方案。

　　总之,微波用于骨髓的体外净化简单有效而又价廉,将微波和药物联合以更好地发挥协同净化作用,有进一步研究的必要。

　　本课题为国家自然科学基金资助项目(No.69172009)

　　参　考　文　献

　　1　单根治,李国庆. 微波抗肿瘤作用研究进展. 国外医学肿瘤学分册,1988,4:197-200.

　　2　Burgess AW, Wilson EMA,Metcalf D. Stimulation by human placental conditioned medium of hematiopoietic colony formation by human marrow cell .Blood, 1977,49:573-578.

　　3　史泓浏,赖声礼,王晓怀,等. 联合方法净化白血病细胞. 国外医学内科学分册,1998,25(2):66-69.

　　4　郑华金,苏毅,薛毅琪,等. 微波净化自体骨髓治疗白血病临床和实验研究. 中华血液学杂志,1991,12:513-515.

　　5　陈国璋. 电磁波非热效应机制的一种理论. 生物化学和生物物理学进展,1986, 6:15-17.

　　6　李继华,赵彼得. 热增敏在恶性肿瘤热化疗中的作用. 中华理疗杂志, 1993,4:228-231.

(收稿　1998-09-29　修回　1999-05-20)