反义bcr/abl核苷酸与CTX联合治疗慢粒白血病的实验研究
CSCO2000年第四届学术年会
张凤春 林玉梅 卢振霞 孙步彤 孙延霞 干慧珠
摘 要 目的：为了探索CML的治疗新方法研究了反义硫代bcr/abl核苷酸（AS-bcr/abl- ODN）与环磷酰胺（CTX）联合应用抑制bcr/abl融合基因表达及诱导K562细胞凋亡方法。方法：采用RT-bcr/abl-PCR、CFU-GM、FCM测定细胞周期DNA-Ladder电泳及K562细胞生长抑制率等方法，观察AS-bcr/abl-ODN+CTX对K562细胞的抑制率、bcr/abl基因表达、细胞凋亡及AS-bcr/abl-ODN对正常CFU-GM的影响。结果：AS- bcr/abl- ODN+CTX对K562细胞的抑制率和诱导凋亡，明显高于AS- bcr/abl和CTX组，下调bcr/abl-mRNA表达。AS- bcr/abl- ODN对正常CFU-GM无明显影响与对照组无明显差异。结论：AS- bcr/abl- ODN+CTX联合应用对K562细胞生长抑制率明显高于单一用药，并且强于二者相加，CTX可能下调bcr/abl基因表达，促进AS- bcr/abl- ODN诱导K562细胞凋亡。因此反义核苷酸+CTX联合应用为反义核酸治疗CML及自体造血干细胞移植体外净化提供了新方法。
关键词：慢性粒细胞白血病；CML；反义硫代bcr/abl核苷酸；化疗；治疗；自体造血干细胞移植
慢性粒细胞白血病（CML）中95%的病人具有特征染色体易位t（9；22）（q34;q11）形成bcr/abl融合基因，bcr/abl基因在CML发病中的作用已无可争议，因而抑制该基因表达，促进CML细胞凋亡已是现代CML治疗新的出发点，因此我们进行了反义硫代bcr/abl核苷酸（AS- bcr/abl-ODN）与环磷酰胺（CTX）联合应用抑制bcr/abl融合基因表达及诱导K562细胞凋亡的研究。
材料和方法
一 、K562细胞株和正常对照细胞：K562细胞株为人类CML细胞株，Ph+ bcr/abl+(b3a2)， 其基因产物为P210（bcr/abl），正常对照来自于非血液病患者的骨髓细胞。
二、 反义核苷酸（AS-OND）合成和修饰：根据K562细胞bcr/abl融合区基因序列b3a2类型合成一条反义bcr/abl核苷酸(AS-bcr/abl-ODN)，（51？GAAAGGGCTTTTGAACTCT-3），和另一条无义S-bcr/abl-ODN,（5-TCTTCCAACTTGGAAGGG-3），并行全硫代修饰。合成，纯化、修饰及质量检测均在美国Cybersyn公司完成。
三、CTX国产——产品，RPMI1640（美国GIBCOBRL LIFE TECHNOLOGIES），蛋白酶K（sigma），甲基纤维（sigma）。
四、AS-bcr/abl-ODN+CTX对K562细胞的抑制率:
1、选择AS-ODN的最适浓度：96孔培养板接种K562细胞,细胞数为2.0×105/孔，AS- bcr/abl-ODN、分别取10、20、40及80μg/ml 4个不同浓度加入各孔中，置5%CO2 ，37℃培养箱中培养。在第24、48、72小时分别在上述各不同浓度的孔中取细胞悬液0.1ml，加0.4%台酚兰液0.9 ml，充分混均计数，计算生长抑制率（=死亡细胞数/总细胞数×100%），计算出最适时间和AS-bcr/abl- ODN最适浓度。
2、AS-bcr/abl-ODN+CTX对K562细胞的抑制率：
将K562细胞接种96孔培养板，细胞数为2.0×105/孔将其分为5组。①对照组；单纯K562细胞。②AS-bcr/abl-ODN组：K562细胞培养1小时后加入AS-bcr/ab- ODN（终浓度为40μg/ml ）。在培养24、48小时分别加入20μg/ml AS- bcr/abODN。③AS- bcr/abl-ODN+CTX组：K562细胞+CTX浓度（终浓度为320μg/ml ）培养1小时后，RPMI1640培养洗涤细胞二次后加入AS- bcr/abl-ODN（终浓度为40μg/ml ）在培养24、48小时分别加入20μg/ml AS- bcr/abl-ODN. ④ CTX组：K562细胞+CTX(终浓度为320μg/ml ）培养1小时后用RPMI洗涤二次后继续培养。⑤S- bcr/abl-ODN组：K562细胞+ S- bcr/abl-ODN浓度同“3”。各组均在5%CO2，37℃ 培养箱中培养72小时取细胞进行检测。
3、 DNA Ladder 电泳检测细胞凋亡（1）
4、流式细胞仪检测细胞周期（1）
五、RT-PCR检测bcr/abl-mRNA表达常规
方法：
PCR引物abl-p 5-CTCAGACCCTGAGGA-
TCAGAGGCT-3bcr-p5-GTTCCTGATCTCCTC0-TGACTATGAGCGTGC-3。 b3a2表达时PCR扩增产物为200bp 荧光区带。
六AS- bcr/abl-ODN对CFU-GM形成的影响：
取骨髓5ml,肝素抗凝，分离单个核细胞，以RPMI1640培养液5ml洗涤二次后，取其10%FCS的RPMI1640培养液1ml悬浮细胞。取其单个核细胞4×105加入每个培养孔中。将其分为3组：1、对照组：单纯单个核细胞。2、S- bcr/abl-ODN 组：单个核细胞+ S- bcr/abl-ODN。3、AS- bcr/abl-ODN组：单个核细胞+ AS- bcr/abl-ODN。”2保?”组分别加入对应ODN（40 μg /ml）,置于5%CO，37 C培养18小时后再次加入ODN（20μg /ml）,继续培养4小时。然后进行半固体培养。培养体系(2.5ml)为细胞1×105/ml,GM-CSF 10ng/ml, 甲基纤维素0.4ml,10%FCS的RPMI1640加至多2.5ml.在5%CO，37 ℃ 培养箱中培养10天。观察CFU-GM（细胞数 ≥50个）形成情况。
结 果
一、AS- bcr/abl-ODN对K562细胞生长抑制率及最适浓度：在时间上72小时抑制率最强。当ODN的浓度为10，20和40μg/ml时，K562细胞生长抑制率 S-bcr/abl-ODN组与对照组无显著变化，而AS-bcr/abl- ODN组随浓度上升生长抑制率显著增加，特别是40μg/L时抑制率为前者的6倍。当80μg/ml时，虽然AS-bcr/abl- ODN组抑制率明显增高，而S- bcr/abl ？ODN组也明显增加。见表1
二、 AS-bcr/abl-ODN+CTX对K562细胞的
抑制率:AS- bcr/abl-ODN+CTX组K562细胞生长抑制率(86.1+5.2%)显著高于AS- bcr/abl ？ODN组(41.5+2.6%)和CTX组(32.1+5.2%)(p＜0.01 )。
三、K562细胞凋亡的检测：
1、LadderDNA电泳AS- bcr/abl- ODN+CTX 组Ladder电泳显示大量的DNA片断形成，呈典型的凋亡DNA梯形带，其荧光强度显著强于CTX组和AS- bcr/abl-ODN组，S- bcr/abl- ODN组与对照组比较无明显DNA片断电梯形形成。见图
2、流式细胞仪检测凋亡细胞对照组及S- bcr/abl - ODN组：A区无细胞。 AS-bcr/abl -ODN+CTX组：A区有大量的细胞，显著多于AS- bcr/abl -ODN 组和CTX组，并无正常周期的细胞。见图
3、AS- bcr/abl -ODN和/或CTX对bcr/abl基因mRNR表达的影响：AS- bcr/abl- ODN+CTX组cDNA带的荧光强度极低，明显低于其它各组。其灰度为102.5±6.3显著低于AS- bcr/abl -ODN组（142.8±8.5），CTX组（146.8±5.8），S- bcr/abl- ODN组（187±6.8）和对照组（182±4.7）（P＜0.01）。AS- bcr/abl- ODN组与CTX组无显著差异（P＜0.05）但显著低于S- bcr/abl- ODN组和对照组 (p＜0.01＝。后者间无显著差异(p0.05)。见图
4、AS- bcr/abl - ODN对正常CFU-GM形成的影响 AS- bcr/abl- ODN组CFU-GM 数（184.7±25.3个）与S- bcr/abl- ODN组（186.4±23.3个）及对照组（179.2±21.9）无显著差异(p＞0.05)
讨 论
AS- bcr/abl-ODN治疗慢性粒细胞白血病近年来不论在实验研究和自体干细胞移植净化白血病细胞的研究方面均取得了一定的疗效。但仍存在着很多问题，硫代修饰ODN抑制核酶水解ODN，增加了通过细胞模，但仍难以达到基因治疗的有效浓度。研究表明未经处理的条件下AS-ODN在细胞内浓度比细胞外低99%(3)。为了解决这一问题我们采用AS- bcr/abl-ODN联合化疗药物治疗慢性粒细胞白血病进行了探讨。
1、 CFU-GM生长的影响：
本实验结果提示：AS- bcr/abl-ODN在一定的范围内（10~40μg/ml）随浓度增加对K562细胞特异性的抑制作用而增加。当浓度增加至一定量（80μg/ml）时，其细胞抑制率虽然增加但S-DON也出现了明显细胞生长抑制作用，呈现明显的非反义抑制而不是AS-ODN的反义性特异性抑制作用。非反义抑制机制可能为：①在硫代（PS）修饰过程中，硫原子取代了磷酸骨架中的氧原子，当PS-ODN分解后产生的硫原子可以与细胞内的酪氨酸激酶、DNA聚合酶及RnaseH 等蛋白结合而干扰细胞生长，引起细胞毒性作用。②Vaerman等(4)的研究提出ODN-3′末端TAT特殊顺序部分决定了ODN的抑制细胞增殖作用，也是具有非特异性。③ODN被核酸外切酶水解末端核苷酸而产生的d NMP的细胞毒性作用（5）。另外本实验中AS- bcr/abl-ODN最佳浓度为40μg/ml。
正常造血干细胞中存在bcr 基因和abl基因，二者在细胞生长及其调节过程中起着重要作用。本实验中所采用的AS- bcr/abl-ODN分别含对应c-abl 和bcr的部分序列。可能对正常的造血干细胞增殖产生影响，本实验结果提示：AS- bcr/abl-ODN及S- bcr/abl-ODN对正常造血干细胞生长均无明显抑制作用。这一结果将对AS- bcr/abl-ODN在造血干细胞移植的体外净化方面应用提供理论依据。
2、 AS- bcr/abl-ODN+CTX联合应用对K562细胞影响及其机制。
本实验结果提示：AS- bcr/abl-ODN+CTX联合应用对K562细胞生长抑制率明显高于单一药物，并且强于二者相加结果，与文献动物体内实验结果相同。其机制可能为：①本实验DNA Ladder电泳及流式细胞仪测定结果显示：CTX可促进AS- bcr/abl-ODN诱导K562细胞凋亡作用。②本实验bcr/abl-RT-PCR结果显示AS- bcr/abl-ODN+CTX可下调bcr/abl-mRNR的表达，进一步诱导细胞凋亡，显著优于单一用药。③动物试验及体外试验表明，在CTX之后应用AS- bcr/abl-ODN可使细胞对其摄入量增加2~6倍，P210bcr/abl蛋白水平也明显下降。因此，反义核苷酸与CTX的联合应用可能为反义核苷酸治疗慢性粒细胞白血病、自体造血干细胞移植体外净化提供新方法。并可能为解决反义核酸应用量过大，价格昂贵而难以临床应用的难点，提供一新线索。
作者单位：白求恩医科大学第三临床学院血液肿瘤科 130031
参考文献
1、张凤春，林玉梅，姜玉珍，等.反义基因逆转肿瘤细胞多药耐药诱导细胞凋亡的研究.中华血液杂志，1997，18：627-629.
2、Skorski T,Skorsa MN,Wlodarski P, et al.J Natl Cancer Inst,1997,89:124-
3、田红，孙竞。Bcr-abl 反义寡核苷酸治疗慢性髓细胞性白血病的研究进展。国外医学-输血及血液学分册，1999，22：229。
4、Clark RE. Leuk Lymphoma, 1995,19:189-
5、Antisense oligodeoxyribonucleotides suppress hematologic cell growth throuugh stepwise release of deoxyribonucleotides. Blood, 1997,90:331-339.
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