阿霉素化疗与热化疗对兔毛细胞白血病VX－2细胞体外作用的比较
癌症 1999年第3期第18卷 基础研究
作者：张洪新 王执民 郭卫平 王义清 吴智群 李文献 陈江浩 关 燕
单位：第四军医大学唐都医院介入放射科(西安，710038)
关键词：阿霉素；热化疗；VX－2
【摘要】目的：观察比较热疗、化疗、热化疗对体外兔VX－2细胞的生长抑制规律的影响，为临床介入性热化疗提供实验数据。方法：以体外长期培养的兔VX－2细胞为靶细胞，采用水浴加温法、进行体外细胞毒试验(MTT法)，观察单纯热疗，单纯化疗及热疗与化疗结合对兔VX－2细胞的生长抑制规律的影响及差别。结果：(1)温热和阿霉素对VX－2均有一定的抑制和杀伤作用，两者一定方式的联合具有协同或相加作用；(2)热化疗加热温度以42～43℃为佳，加热时间以30分钟以上为佳。结论：(1)热对化疗有增敏作用；(2)一定温度的热化疗优于单纯热疗和单纯化疗。
中图号：R7357 文献标识码：A 文章编号：1000－467X(1999)03－0276－03
Synergistic effect of combined use of hyperthermia and
adriamycin (ADM) on rabbit hairy cell line VX－2
ZHANG Hong－xin WANG Zhi－min GUO Wei－ping,et al
Department of Interventional Radiology,Tangdu Hospital,Fourth
Military Medical University, Xian 710038,China
【Abstract】Objective：To observe the inhibition of cell growth of VX－2 with MTT assay under water－heating with ADM.Method：The hare leukemia VX－2 cell line was used in this study.The inhibiton of cell growth was observed with MTT assay under water－heating with ADM.Results：1.Both hyperthermia and ADM can inhibit or kill the VX－2 cells directly.The combination use of hyperthermia and ADM shows evidence of synergistic or additional effect.2.The optimal temperature and time of hyperthermia are 42～ 43 ℃ and 30 minutes.Conclusions：1.Hyperthermia enhanced the efficacy of chemotherapy,2.Hyperthermia of definite temperature showed better effect than those of heat or chemotherapy alone.
Key words：Adriamycin(ADM);Thermochemotherapy;Hare cell line;VX－2
热疗对肿瘤的抑制效应已广为接受，成为肿瘤治疗的一种方法[1]。热疗一般采用射频方式，操作复杂，加热时间长，病人难以接受而限制了应用。由于介入放射医学的发展，使解决这个问题成为可能，即通过导管将一定温度的热盐水或热的化疗药物注入局部肿瘤病灶，可以称之为介入性热化疗。为了制定安全合理的介入性热化疗方案，我们采用MTT比色法，研究了临床常用的阿霉素(ADM)与热疗结合对兔VX－2作用的最佳温度，最佳加热时间，及最佳组合方式，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
兔VX－2由本校实验动物中心提供，按常规方法培养于含10％小牛血清的RPMI－1640全培养液中(含青霉素PC)100U/ml，链霉素(SM)100μg/ml)，单层培养于37℃CO2恒温孵育箱内，用接种传代第3天的细胞(处于对数生长期)做实验。
1.2 加热处理
设37℃，40℃，41℃，42℃，43℃，44℃等6个温度点。采用水浴加热法，(数字式恒温浴槽，温度波动≤±01℃)，将培养瓶浸没于水中，加热时间设0，15，30，60分钟共4组。
1.3 药物处理
阿霉素(ADM，FarmitaliaCarloErba)，设0，1，2，4，8，16，32，64μg/ml等共8组，用微量进样器加药。
1.4 热药顺序
先化后热(先化疗1小时再热疗)，热化同时(加热同时加药化疗1小时)，先热后化(先加热后化疗1小时)
1.5 实验分组设计
按不同温度、不同加热时间、不同热化顺序和不同药物浓度4个因素设计，即组内分组设计，化疗时间统一为1小时，将实验处理过的细胞消化成细胞悬液(5×105个细胞/ml)接种到96孔板上，设3个复孔，每孔200μl(1×105个细胞/ml)，以未经处理的细胞为阴性对照，以不含细胞的1640全培养液为空白对照，常规法孵育24小时后每孔加入MTT50μl，继续培养4～6小时，去上清液后加入二甲基亚砜(DMSO)100μl/孔，充分振荡5分钟，上酶联免疫检测仪，测定波长490nm每孔的光密度值(A值)，计算细胞毒指数(CI)公式：
CI值=(1－实验孔的平均OD值/阴性对照孔的平均OD值)×100％
1.6 统计学处理
采用方差分析，Q检验。
2 结果
2.1 单纯热疗的细胞毒作用
42℃30min以下较弱；43℃30min以上较强；超过44℃CI值接近100％；低于41℃30min同37℃没有明显差别(如图1)。
图1 单纯热疗
2.2 单纯化疗的细胞毒作用(常温37℃非热化疗)
2μg/ml以下较弱；超过2μg/ml则随着浓度提高而CI值明显增强，32μg/ml时CI值接近100％(如图2)。
图2 单纯化疗1小时
2.3 热疗和化疗联合的细胞毒性作用
随着温度提高，CI值增大，曲线上移，42℃以上显著(如图3)；随着热疗的时间延长，CI值亦增大，曲线上移，30min以上显著(如图4)；随着温度升高和时间延长，取得相同CI值所需药物浓度降低。提示浓度，温度，时间之间有一定关系(如图3，4)。
图3 不同温度化疗加热30分
图4 43℃不同时间化疗
2.4 热疗与化疗顺序的影响
同一浓度和温度下，顺序不同，CI值有所不同。同一温度下，4～16μg/ml间，先化后热与热化同时有差异(P＜0.05)，两者与先热后化差异显著(P＜0.01)，但2 μg/ml以下及32μg/ml以上差异不显著(P＞0.05)。同一浓度(8μg/ml)下，42～43℃间，结果同上，但41℃以下和44℃以上差异不显著(P＞0.05)(如图5，6)。
图5 43℃不同热化顺序
图6 相同浓度(μg/ml)加热30分钟不同热化顺序
3 讨论
3.1 ADM对热疗的抑制效应具有增效作用
ADM是周期非特异性药物，主要作用机制是在NA复制过程中诱导TOPOⅡ抑制剂—DNA断裂复合物的形成，引起细胞死亡或停滞于S期，G2[2]。由于ADM使大量细胞处于S期，S期对热最感[3]，因此先化后热毒性作用较强，是化疗对热的增效。
3.2 高热对细胞具有明显抑制效应
高热对细胞膜具有独特作用，可改变生物膜的流动性，导致细胞浆破坏；高热能抑制细胞DNA，RNA，蛋白质的合成与修复；高热可以改变细胞膜的通透性，提高胞浆中的药物浓度。S期的细胞对热最敏感，慢性乏氧细胞对热最敏感，一定温度可引起蛋白质和DNA变性称热变性[1，4，5]。但温热必须达到一定温度对细胞才有毒性，乏氧的肿瘤细胞比正常组织细胞对热更敏感。本实验中看出单纯热疗43℃30min以上毒性较强，超过44℃VX－2细胞几乎全部死亡，即热变性作用，低于41℃、30min较弱。因此在体内应用时，既要注意温度过高对正常细胞的损伤，又要注意温度不能过低以致影响疗效。介入治疗中要尽可能超选择插管到肿瘤靶血管内。
3.3 热对化疗有增敏作用
42～43℃化疗作用明显强于37℃化疗如(图3，4)提示浓度、温度、时间之间存在一定关系。一定范围内，随着温度提高，达到相同CI值所需药物浓度降低，说明高热对化疗具有热增敏作用。低于这一范围，药物的毒性起主要作用，浓度越高作用越强；高于这一范围，热变性起主要作用，温度越高作用越强。一定浓度范围内，同一浓度，43℃的CI值是37℃的10倍以上，即化疗毒性增强10倍以上。
3.4 ADM热化疗
先化后热强于热化同时，后者强于先热后化。不同的药物与热疗联合的最佳顺序不同，如丝裂霉素与热和药同时应用效果最佳[6]。在本实验中发现ADM与热合用，效果依次为先化后热，热化同时，先热后化，这是由药物的机理决定的。ADM与热疗相互增敏作用机理可能为：(1)ADM使对高热敏感的S期细胞增多；(2)热疗增加细胞膜的通透性，提高细胞内的药物浓度。作者在另一研究中，通过流式细胞仪检测加热前后细胞内阿霉素荧光强度，已证实加热可提高细胞浆中的药物浓度(文章正待发表)；(3)高温可使蛋白质变性，高热同样可使酶的活性受到抑制，障碍DNA的修复。
本实验从一定角度对VX－2的ADM热化疗规律进行了研究，下一步准备建立兔VX－2肝移植性癌模型，并以此模型为研究对象，以本实验结果为指导，研究在体热化疗的疗效，温度控制及安全性等问题，为临床介入性热化疗提供指导。
参考文献
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收稿日期：1998－05－25；修回日期：1998－10－21
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