大蒜素诱导卵巢癌细胞株OVCA-3凋亡

　　第二军医大学学报1999年第20卷第5期

俞超芹　凌昌全　潘瑞萍　黄雪强　张登海

　　摘　要　目的:探讨大蒜素诱导卵巢癌细胞株OVCA-3凋亡规律。方法:应用DNA断裂点标记（TUNEL）法、DNA凝胶电泳以及光镜等技术观察有关细胞的凋亡情况。结果:0.01～100μg/ml的大蒜素作用OVCA-3细胞2h及10μg/ml的大蒜素作用OVCA-3细胞不同时间，锥虫蓝染色阳性率均在18.5%以下。TUNEL显示：1～100μg/ml的大蒜素作用OVCA-3细胞2h，即出现典型的细胞凋亡特征；50μg/ml时凋亡率为65.9%。结论:一定剂量范围内的大蒜素可在直接杀伤作用较小的情况下明显诱导OVCA-3细胞凋亡，不会因细胞坏死而引起炎症反应，这对于大蒜素应用于临床将有重要意义。

　　关键词：卵巢肿瘤　大蒜素　细胞凋亡

　　大蒜素是大蒜的一种有效成分，主要用于治疗真菌感染。近年来的研究表明，大蒜素可以预防和治疗肿瘤^［1～3］。本研究利用DNA原位末端标记（TUNEL）法和DNA凝胶电泳技术观察大蒜素对人卵巢癌细胞株（OVCA-3）的作用情况。现报告如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　细胞培养　OVCA-3细胞由上海医科大学妇产科医院提供，用含10%小牛血清的RPMI1640（Gibco公司）完全培养液37℃CO₂孵箱内培养，潮湿空气中含有5%CO₂。

　　1.2　试剂　大蒜素（二烯丙基硫代磺酸酯）为上海禾丰制药有限公司生产，30mg(2ml),批号：950901。TUNEL标记液、Streptavidin-AP、碱性磷酸酶底物（NBT/BCIP）等主要试剂均购自德国宝灵曼公司。

　　1.3　大蒜素对OVCA-3细胞剂量毒性实验　调整OVCA-3细胞密度为2.5×10⁵个/ml，1ml细胞悬液接种在进口24孔板中,在5%CO₂培养箱中培养，24h后加不同浓度大蒜素。对照组为空白对照。继续培养2h后锥虫蓝染色,计算细胞死亡率。

　　1.4　大蒜素对OVCA-3细胞时间毒性实验　调整OVCA-3细胞密度为2.5×10⁵个/ml，接种细胞悬液1ml于进口24孔培养板中，继续培养，24h后加终质量浓度为10μg/ml的大蒜素于各孔中，分别于30，60，90，120，150，180min用0.4%锥虫蓝染色，计数死细胞。

　　1.5　TUNEL法　调整OVCA-3细胞密度为2.5×10⁵个/ml，在进口6孔培养板中放入无菌盖玻片，接种细胞悬液2ml于6孔培养板中的盖玻片上，继续培养，24h后加入不同浓度大蒜素。另设0.2μg/ml羟基喜树碱对照组及空白对照组。加药2h后在6孔培养板中加入40%甲醛50μl于各孔，固定5min,2500r/min离心15min，取出盖玻片，PBS洗涤2次，加穿透液（含0.1%TritonX-100，0.1%NaAc）200μl,PBS洗涤，晾干。于37℃水浴用TUNEL标记液作用60min。加Streptavidin-AP置37℃水浴30min。碱性磷酸酶底物（NBT/BCIP）显微镜下显色。核固红复染细胞核。自然干燥后中性树胶封片。显微镜下计数100个细胞(共3个视野)，细胞核染成蓝色为阳性细胞，计算阳性率。

　　1.6　核酸电泳　调整细胞密度为2.5×10⁵个/ml，接种细胞悬液2ml于6孔板中,培养24h后,加入终质量浓度分别为0.1，1，10，50，100，200μg/ml的大蒜素，并设空白对照。2h后收集细胞悬液。每孔加DNA抽提液（含TBE，RNase，NP-40等）20μl，50℃水浴，60min。加蛋白酶K3μl（10mg/ml），50℃水浴，2h。用1.8%琼脂糖凝胶电泳,50V2h,EB染色,紫外灯下观察DNA电泳结果。

　　2　结　果

　　2.1　大蒜素对OVCA-3细胞剂量毒性实验结果　结果显示，0.01～100μg/ml的大蒜素作用OVCA-3细胞2h时,锥虫蓝染色阳性率均在18.5%以下。0.01～1μg/ml阳性率与空白对照接近，10μg/ml时升至最高，至50～100μg/ml时又呈下降趋势。

　　2.2　大蒜素对OVCA-3细胞时间毒性实验结果　用10μg/ml大蒜素作用不同时间，细胞锥虫蓝染色阳性率均在18.5%以下。空白对照组培养不同时间的细胞染色阳性率均在10.9%以下(图1）。

　　图1　大蒜素时间毒性实验

　　Fig 1　Allicin toxicity experiment in different time

　　○: Control ; ● :Allicin 10 μg/ml

2.3　TUNEL标记　正常OVCA-3细胞为梭形，细胞间连接成片（图2A）；细胞收缩变圆，核染成蓝色的为凋亡细胞（图2B，2C）。TUNEL剂量凋亡实验显示：1μg/ml的大蒜素作用OVCA-3细胞2h时,细胞出现明显凋亡；随着剂量的增大，凋亡率逐渐上升，大蒜素剂量50μg/ml时达到高峰，凋亡率为65.9%。

　　图2　正常OVCA-3细胞及凋亡细胞TUNEL标记

　　Fig 2　TUNEL on OVCA-3 cells of normal and apoptosis

　　a:Normal OVCA-3 cells(×40); B:Induced by allicin(×100);

　　c: Induced by hydroxycamptothecine(×40)

　　2.4　DNA凝胶电泳　不同剂量的大蒜素作用于OVCA-3细胞2h,均未出现明显的DNA“梯子”（ladder）。

　　3　讨　论

　　大蒜为百合科葱属植物的鳞茎，辛温健脾、清痈肿、破症积，并有很强的杀菌消炎作用。随着研究的深入，人们发现大蒜素有明显的抗癌作用，如大蒜素可显著抑制K562和HR8348细胞株的增殖，阻留S期的细胞于G2/M期，并对抗癌药有增敏作用^［4，5］。肿瘤的发生、发展与细胞增殖和凋亡的不平衡有关。大蒜素既对肿瘤细胞的增殖有抑制作用，也可能诱导肿瘤细胞调亡。

　　细胞凋亡是Kerr最早提出的，他于1971年通过电镜观察发现，细胞有两种不同的死亡方式，后来分别被称为坏死（necrosis）和凋亡（apoptosis）。这两类细胞死亡方式具有不同的发生机制及形态学、生物化学特征，可用多种细胞生物学方法区分。凋亡的典型特征是：DNA降解为特征性的80～200bp片段，表现“梯子”状DNA条纹；染色质早期边缘化，后期片段化，这主要是由于凋亡过程中核酸内切酶活化的结果。而细胞坏死虽有DNA的降解但不形成寡聚核小体，DNA在整个分子链上随机断裂；也没有染色质边缘化、片段化现象。凋亡的另一显著特征是细胞膜保持完整性，在体内这种膜的完整性直至凋亡小体被吞噬细胞吞噬。而坏死细胞则在早期就由于细胞膨胀而丧失膜完整性。

　　TUNEL法可早期检测及原位检测细胞凋亡，这种方法较DNA电泳法与DNA含量测定法有明显优点。根据TUNEL法结果，大蒜素在1μg/ml时即明显诱导OVCA-3细胞凋亡,50μg/ml达到高峰,凋亡率为65.9%。

　　不同剂量大蒜素作用OVCA-3细胞2h，DNA电泳未出现明显的DNA“梯子”。我们推测可能与大蒜素在诱导OVCA-3细胞凋亡时未出现DNA片段有关。有观点认为，凋亡细胞中有80～200bp的DNA片段是凋亡细胞具特征性的生化表现的观念已受到挑战，因为研究发现，有些细胞尽管出现典型的凋亡形态，但并没有80～200bp的DNA片段，代之出现的是5×10³～3×10⁴bp的DNA大片段^［6］。还有研究表明，在细胞凋亡时可不出现DNA片段。有些细胞尽管出现了DNA片段，最终表现为坏死而不是凋亡^［7］。

　　作者简介：俞超芹，女，1964年9月生，硕士，副教授

　　作者单位　俞超芹　凌昌全　潘瑞萍　黄雪强　张登海　第二军医大学长海医院中医科，上海，200433

　　参考文献

　　1　陆婉琴,金杏泉,徐静芳.大蒜素对抗癌药物作用的初步研究.肿瘤，1992，12（8）：113

　　2　解云涛，杨国梁，杨庆忆,等.大蒜素对小鼠S180的抑制作用及NK细胞活性的影响.癌症，1995，14（3）：179

　　3　张桂梅,冯作化,郝天玲,等.大蒜素对巨噬细胞介导的细胞毒作用的影响.中国中药杂志，1996，21（1）：45

　　4　杨渝珍，梁远军，张永忠,等.大蒜素抑制人急性早幼粒白血病细胞生长的体外实验.肿瘤，1995，15（2）：72

　　5　曹　江，杨　骅，吴　伟,等.应用流式细胞术研究大蒜素对肿瘤细胞周期的影响.癌症，1996，15（6）：401

　　6　张登海.一氧化氮与细胞凋亡.见:钟慈声主编.一氧化氮生物医学.上海:上海医科大学出版社,1997.126

　　7　Bortner CD, Oldenburg NBE, Cidlowski JA. The role of DNA fra gmentation in apoptosis. Trends Cell Biol, 1995, 5(1) :21