CD₃AK细胞对人卵巢癌细胞系的体外杀伤作用

临床与实验病理学杂志 1999年第1期第15卷 实验研究

作者：钱丽娟　许沈华　牟瀚舟　羊正炎

单位：钱丽娟　许沈华　牟瀚舟　羊正炎（浙江省肿瘤医院妇科，杭州　310022）

关键词：卵巢肿瘤；淋巴结；抗体；CD3；细胞系

　　摘要　目的：研究卵巢癌盆腔引流淋巴结的淋巴细胞，经CD₃单克隆抗体激活后的杀伤细胞CD₃AK(CD₃ activated killer cells)在体外的抗瘤作用。方法：采用卵巢癌病人盆腔引流淋巴结的淋巴细胞，在体外与CD₃单抗和少量rIL-2诱导并激活后，在两株人卵巢癌HO-8910、HO-8910PM细胞系上进行实验研究。将两株细胞各随机分成6组：(1)阴性对照组(A组)：只加新鲜全培养液；(2)低浓度CD₃AK组(B组)：5×10⁵*L^-1 CD₃AK培养液；(3)中浓度CD₃AK组(C组)：1×10⁹*L^-1 CD₃AK培养液；(4)高浓度CD₃AK组(C组)：2.5×10⁹*L^-1 CD₃AK培养液；(5)顺铂阳性对照组(E组)：含10 mg*L^-1顺铂培养液；(6)顺铂+CD₃AK联合用药组(F组)：含10 mg*L^-1顺铂+1×10⁹*L^-1 CD₃AK培养液，分别用LDH活性测定、自然杀伤率及台盼蓝活细胞计数法进行了观察。结果：CD₃AK细胞对卵巢癌细胞有明显的杀伤作用，两株细胞均以中浓度CD₃AK细胞就显示了较好的细胞毒活性作用(P＜0.01)，统计学上差异有高度显著性。CD₃AK细胞与顺铂联合用药时，无论在细胞增殖抑制LDH活性(OD值)测定或自然杀伤率均显示了对两株细胞有较明显的细胞毒活性作用(P＜0.001)。结论：CD₃AK细胞对人卵巢癌细胞有杀伤作用，CD₃AK与顺铂联合用药有较好的协同抗卵巢癌作用。

　　中国图书分类号　R737.31； R322.25； R730.51　　文献标识码　A　　文章编号　1001-7399(1999)01-0054-03

The kill effect of CD₃AK cells on human ovarian cancer cell line

Qian Lijuan, Xu Shenhua, Mou Hanzhou et al

　　(Zhejiang Cancer Research Institute, Hangzhou　310022)

　　ABSTRACT　Purpose　In order to study anti-tumor effects of lymphocytes of draining lymph nodes in pelvic cavities in patients with ovarian cancer, which were activated by CD₃McAb in vitro.Methods　Both two cell lines were divided into 6 groups respectively and randomly: (1) Negative contrast group (A): only adding fresh complete culture medium; (2) Low consistency CD₃AK group (B): 5×10⁵*L^-1 CD₃AK culture medium; (3) Middle consistency CD₃AK group (C): 1×10⁹*L^-1 CD₃AK culture medium; (4) High consistency CD₃AK group (D): 2.5×10⁹*L^-1 CD₃AK culture medium; (5) Cisplatin positive contrast group (E):10 mg*L^-1 cisplatin culture medium; (6) Usage of combination of cisplatin + CD₃AK group (F):10 mg*L^-1 cisplatin + 1×10⁹*L^-1 CD₃AK culture medium. In this study, LDH level in the culture fluid and cellular count were used to investigate the kill effects.Results　The results showed that CD₃AK cells had obvious kill effects on ovarian cancer cells. Middle consistency CD₃AK cells showed cell toxic effects on two cell lines. The usage of combination of cisplation + CD₃AK group had stronger kill effects than that of cisplatin group alone (P＜0.01).Conclusion　CD₃AK has kill effects on ovarian cancer cells. The usage of combination of cisplatin + CD₃AK have cooperative resist effects on ovarian cancer.

　　KEY WORDS　 ovarian neoplasms; lymph nodes; antibady, CD₃; cell line

　　CD₃AK(CD₃ activated killer cells)是抗CD₃单克隆抗体激活的杀伤细胞。其增殖能力及抗肿瘤细胞毒活性均显著优于LAK细胞，故日益受到重视^〔1～3〕。本实验采用人卵巢癌病人盆腔引流淋巴结分离的淋巴细胞，经CD₃单抗诱导激活后，在自建的人卵巢癌细胞系上，研究CD₃AK细胞对人卵巢癌细胞的体外杀伤作用。

　　1　材料和方法

　　1.1　细胞来源　人卵巢癌HO-8910细胞系由本所1989年建立^〔4〕：高转移人卵巢癌HO-8910PM细胞系也是本所从HO-8910细胞接种于裸鼠体内传代后肺转移灶行体外培养后建立。两株细胞均按常规体外传代，每周传代或换液2次。

　　1.2　抗体及IL-2来源　CD₃单抗为鼠源性，军事医学科学院生物制剂发展中心产品；基因重组IL-2北京四环生物工程制品厂生产(军事医学科学院生物工程研究所监制)。

　　1.3　细胞培养条件　美国产RPMI-1640培养基内补充15%热灭活胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所产品)，每毫升含青霉素100 U、链霉素100 μg、胰岛素0.01 U、氢化可的松10 μg。在37℃、5% CO₂条件下培养。

　　1.4　CD₃AK的诱导　在术中无菌条件下取卵巢癌患者盆腔清扫淋巴结数枚，各取半枚送病理检查，半枚淋巴结用机械方法在280目的坦网上剪碎并轻轻碾磨，用茶叶滤纸过滤制成单细胞悬液，然后用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，在含有0.5 mg·L^-1 CD₃单抗的培养液中将细胞调至1×10^9.L^-1，置37℃ 5% CO₂培养箱中培养24 h，经离心去上清液，重新加入含有0.5 mg·L^-1 CD₃单抗和5×10⁴ U·L^-1重组人IL-2的新鲜培养液，继续培养5天，用于体外人卵巢癌细胞的杀伤及抑制作用的实验。

　　1.5　实验分组　取生长良好的HO-8910、HO-8910PM两株细胞，消化制成1×10^8.L^-1每瓶3 ml，在37℃、5% CO₂培养箱中培养72 h，分别随机分成6组：(1)阴性对照组(A组)只加新鲜全培养液；(2)低浓度CD₃AK组(B组)：1×10^8.L^-1 CD₃AK培养液；(3)中浓度CD₃AK组(C组)：1×10^9.L^-1 CD₃AK培养液；(4)高浓度CD₃AK组(D组)：2.5×10^9.L^-1 CD₃AK培养液；(5)顺铂阳性对照(E组)：含10 mg·L^-1顺铂培养液；(6)顺铂+CD₃AK联合用药组(F组)：含10 mg·L^-1顺铂+1×10^9.L^-1 CD₃AK培养液，待培养72 h后弃去原培养液，按组分别换入不同的培养液，阴性对照组同样换液，再培养96 h后观察结果。

　　1.6　实验细胞上清液中LDH检测　两株细胞各组取上清液，按文献^〔5〕方法，用酶标仪(Clini Biol28,美国SLT Labinstrument公司产品)测定波长为492 nm，每组5个复孔，计算平均值，并按公式求得自然杀伤率。

　　自然杀伤率(%)=

　　1.7　台盼蓝排除法活细胞计数　两株细胞各组进行活细胞计数，重复4次求得平均值。

　　2　结果

　　2.1　CD₃AK对卵巢癌细胞LDH的影响　从表1可见CD₃AK细胞对两株卵巢癌细胞均有一定的细胞毒活性作用，所设定的3个稀释浓度(1∶5、1∶10、1∶25)以中浓度就显示了较好的细胞毒活性，HO-8910细胞C、D组与A组比较分别为P＜0.01和P＜0.05，HO-8910PM细胞C、D组与A组比较分别为P＜0.01和P＜0.05。两株细胞的F组与A组比较均为P＜0.01，而F组与E组比较，HO-8910细胞差异无显著性，HO-8910PM细胞P＜0.01。从细胞的自然杀伤率来看，随CD₃AK浓度的增高而增强，然而联合用药组在两株细胞中均显示了较高的杀伤率，较单用顺铂的阳性对照组杀伤作用强，显示了CD₃AK有较好的协同顺铂抗卵巢癌作用。

表1　CD₃AK对HO-8910和HO-8910PM细胞系LDH的影响

组　别	HO-8910细胞			HO-8910PM细胞
	OD值(±s)	自然杀伤率 　　(%)	P值	OD值 　　(±s)	自然杀伤率 　　(%)	P值
阴性对照组(A)	0.100±0.0350			0.100±0.0349
CD3AK低浓度组(B)	0.128±0.0042	23	＜0.01	0.122±0.0691	18	＞0.05
CD3AK中浓度组(C)	0.129±0.0025	24	＜0.01	0.120±0.0237	17	＜0.05
CD3AK高浓度组(D)	0.134±0.0168	28	＜0.01	0.130±0.0255	25	＜0.05
顺铂阳性对照组(E)	0.190±0.0961	75	＜0.01	0.190±0.0150	75	＜0.01
联合用药组(F)★	0.200±0.0559	83	＜0.001	0.209±0.0199	90	＜0.001

　　^★F组与E组比较：HO-8910 P＞0.05，HO-8910PM P＜0.012.2　CD₃AK对卵巢癌细胞增殖抑制作用的影响　用台盼蓝排除法活细胞计数结果见表2，CD₃AK对卵巢癌细胞的抑制作用随CD₃AK浓度的增高而抑制作用增强，HO-8910细胞C、D组与A组比较分别为P＜0.05和P＜0.01，HO-8910PM细胞C、D组与A组比较为P＜0.01。两株细胞的联合用药组细胞抑制作用最为明显，均较顺铂阳性对照组细胞数少，但两者间在统计学上差异无显著性。

表2　CD₃AK对HO-8910和HO-8910PM细胞增殖抑制作用的影响

^★F组与E组比较：两株细胞均 P＞0.05

　　3　讨论

　　CD₃是T淋巴细胞上的一种分化抗原，与T细胞抗原受体一起构成TCR-CD₃复合物，在T细胞识别抗原及活化过程中起重要作用^〔6〕。实验证明几乎所有外周血T细胞均可被CD₃抗体激活，其激活细胞明显高于LAK细胞，大量的实验研究与LAK细胞对比表明，CD₃AK细胞在体内外有更强的抗瘤作用^{〔1，7，8〕}。我们采用人卵巢癌病人盆腔引流淋巴结的淋巴细胞，在体外用CD₃单抗激活后输注载有高转移人卵巢癌的裸鼠体内实验性治疗，显示了CD₃AK细胞有抗肿瘤生长和抗转移疗效，CD₃AK治疗组1/7只裸鼠肿瘤消退，仅2/7只裸鼠发生转移，与对照组8/10只裸鼠出现转移灶比较差异有显著性(P＜0.05)^〔9〕。在此工作的基础上，用同样的方法诱导和激活的杀伤细胞CD₃AK用3个不同的稀释浓度在我们自建的两株人卵巢癌HO-8910、HO-8910PM细胞系上进行了初步实验研究，并用顺铂作阳性对照，结果表明：CD₃AK细胞在体外对卵巢癌细胞有一定的杀伤作用，以中浓度CD₃AK细胞就显示了较好的细胞毒活性作用，统计学上差异有非常显著性。联合用药组无论在细胞增殖抑制、LDH活性(OD值)测定或自然杀伤率均显示了对两株卵巢癌细胞有较显著的细胞毒活性作用，而这种细胞毒活性在HO-8910与HO-8910PM细胞之间没有明显的差别，实验结果提示CD₃AK能抑制卵巢癌细胞生长，与顺铂联用有较显著的协同抗卵巢癌作用。

　　综上认为，用卵巢癌盆腔引流淋巴结的淋巴细胞经CD₃和IL-2诱导并激活后的CD₃AK细胞能有效地抑制卵巢癌细胞生长和显示细胞毒活性作用，这种细胞毒活性作用可能与依赖PKC有关。PKC是T细胞活化信息传递过程中一个重要物质，CD₃AK细胞通过PKC对T细胞的活化，激活一系列底物酶，从而启动T细胞活化增殖，发挥了抗瘤活性。深入的研究将为临床卵巢癌患者或其他肿瘤患者，应用CD₃AK细胞进行抗肿瘤免疫治疗提供依据。

　　基金项目：浙江省医药卫生科研基金资助项目(No 96001)

　　作者简介：钱丽娟，女，44岁，主管技师

　　羊正炎，男，46岁，副主任医师，妇科主任

　　参考文献

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　　2，王立新.抗CD₃激活的杀伤细胞的研究进展.上海免疫学杂志，1994；14(3)：192

　　3，Callinger S, Hoskin DW, Mullen JBM et al. Comparison of cellular immunotherapies and anti-CD₃ in the treatment of Mac38-LD experimental hepatic metastasea in C57BL/6 Mice. Cancer Res, 1990;(50)：2 476

　　4，牟翰舟，许沈华，张奕荫等.人卵巢癌细胞系HO-8910的建立及生物学特性.中华妇产科杂志，1994；29(3)：162

　　5，陈丙莺，马建吟，黄钦田等.简易自然杀伤试验—LDH释放改良法.上海免疫学杂志，1989；9(4)：218

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　　9，许沈华，钱丽娟，牟翰舟等.CD₃AK细胞在裸鼠体内抗转移作用的研究.中华病理学杂志，1998；27(1)：46

收稿日期：1998-09-30