白细胞介素-2基因转导对卵巢癌细胞SKOV3形态及增殖的影响

中华妇产科杂志 1998年第10期第33卷 论著

作者：张震宇　郎景和

单位：100073 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科［张震宇(现在北京军区总医院妇产科)，郎景和］

关键词：卵巢肿瘤；白细胞介素-2；基因转移；细胞分裂

　　【摘要】　目的　观察白细胞介素-2(IL-2)基因转导对卵巢癌细胞镜下形态及增殖性的影响。方法　构建携带IL-2基因逆转录病毒载体，将IL-2基因导入卵巢癌细胞系SKOV3，观察细胞光镜下的形态和超微结构的变化，测定细胞核分裂相、生长曲线、³H-TdR掺入量及细胞周期。结果　以质粒pPSRV/IL-2为模板，聚合酶链反应(PCR)扩增出IL-2 cDNA功能编码区，长490 bp，插入逆转录病毒载体pLXSN构建携带IL-2基因载体pLIL-2SN，包装后导入卵巢癌细胞系SKOV3。培养上清液IL-2活性24小时为30～318 U/10⁶细胞。与亲本细胞相比较，光镜下IL-2基因修饰细胞体积增大、形态趋于一致、核浆比缩小；电镜下IL-2基因修饰细胞质高度空泡化，染色质集聚。SKOV3/IL-2细胞核分裂相减少、生长缓慢，倍增时间由38.4小时延长为65.4小时，³H-TdR掺入量下降52.3%。细胞周期分析显示，细胞阻滞于G₀/G₁期。结论　逆转录病毒可有效介导IL-2基因导入卵巢癌细胞，并长期表达；IL-2基因转导可引起肿瘤细胞形态和超微结构的变化，这种改变可能预示肿瘤细胞生物学特性的变化；IL-2基因转导可抑制SKOV3细胞增殖。

　　Interleukin 2 Gene Transfer on the Proliferation and Morphology of Ovarian Cancer Cell Line SKOV3　Zhang Zhenyu, Lang Jinghe. General Hospital of Beijng Military Command, Beijing, 100700

　　【Abstract】　Objective　To study the effect of interleukin-2(IL-2) gene transfer on the proliferation and morphology of ovarian cancer cell line SKOV3. Method　IL-2 gene was introduced into ovarian cancer cell line SKOV3. The morphologic changes, mitosis, proliferation curve,³H-uptaking and cell cycle were studied.Results　IL-2 cDNA， 490bp, was transduced. IL-2 gene expression was detected. IL-2 activity was 30～318 U/10⁶ cells/24hr. IL-2 gene modified cell is squamas like with smaller nucleus/cytoplasm ratio, lager cell area and more homogeneous. The ultrastructural study showed that the cytoplasma of IL-2 gene modified cells is markedly vacuolized and the chromatin is condensed. There was less mitosis found in SKOV3/IL-2 cells. SKOV3/IL-2 cell proliferate more slowly， the doubling time prolonged from 38.40hr to 65.36hr,³H-uptaking decreased 52.3% of the parent cell. The cell cycle study showed that SKOV3/IL-2 cell was blocked to phase G₁/G₀.Conclusions　The retrovirous vector can transduce Il-2 gene into ovarian cancer cell line SKOV3 effectly. IL-2 gene transfer can induce morphologic changs of SKOV3 cells, which may indicate the biologic behavior changes of the targets. IL-2 gene transfer can induce the proliferation inhibition of SKOV3 cells.

　　【Key words】　Ovarian neoplasms　　Interleukin-2 gene 　　Gene transfer　　Cell division

　　细胞因子基因导入卵巢癌细胞的研究刚刚开展，白细胞介素-2(IL-2)基因转导对卵巢癌细胞生物学特性的影响尚不清楚^［1］。本研究将人IL-2 cDNA导入卵巢癌细胞系SKOV3，建立了IL-2分泌的卵巢癌细胞，初步观察了IL-2基因转导对卵巢癌细胞形态及增殖的影响。

材料与方法

　　一、携带人IL-2基因逆转录病毒载体的构建

　　以携人全长IL-2 cDNA质粒(pPSRV/IL-2)为模板，扩增IL-2功能区(pPSRV/IL-2及IL-2引物，均由军事医学科学院基础医学研究所惠赠)具EcoR I和BamH I酶切位点，序列为：P1∶5＇GGGAATTCACAATGTACAGGATGCAACTC 3＇；P2∶5＇GGGGATCCGGGAAGCACTTAATTATCAAGTTA 3＇。

　　逆转录病毒载体pLXSN(军事医学科学院基础医学研究所二室提供)及IL-2聚合酶链(PCR)反应片段分别经EcoR I和BamH I酶切、去磷酸化，加T₄噬菌体DNA连接酶(Promega公司产品)后温育，取连接反应产物转化感受态大肠杆菌，挑选单菌落扩增鉴定。

　　二、携IL-2基因载体的包装及病毒滴度测定

　　1.转染：将脂质体与质粒溶液混合，转染包装细胞PA317，经G 418筛选2～3周，采用有限稀释法将G 418抗性细胞单克隆化。

　　2.病毒滴度测定：收集1×10⁶对数生长期IL-2基因修饰PA317细胞的24小时培养上清液，将其按1∶10、1∶100、1∶1 000稀释，取1 ml稀释液转染3T3细胞，经G418筛选2～3周后，记数阳性集落数。每个集落代表一个具有感染能力的病毒，病毒滴度计算公式为：

病毒滴度(CFU/ml)=阳性集落数×病毒上清稀释倍数×10

　　三、包装细胞的鉴定

　　以基因修饰PA317细胞的基因组DNA为模板，进行PCR反应，扩增外源基因片段Neo基因和IL-2基因。循环参数：94℃变性1分钟，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，共35个循环，反应结束后72℃延伸7分钟，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。Neo基因引物(由军事医学科学院基础医学研究所惠赠)跨越349bp，序列为：P1: 5' TCCATCATGGCTGATGCAATGCGGC 3'；P2: 5' GATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCG 3'。

　　四、IL-2基因导入SKOV3细胞及IL-2活性测定

　　1.转染：将1×10⁵对数生长期SKOV3细胞接种于25 cm²培养瓶，待80%细胞融合时，取2 ml包装细胞病毒上清液（含8 μg/ml Polybrene）与对数生长期SKOV3细胞共同培养，经G418筛选，采用有限稀释法获取单细胞，并扩增。

　　2.IL-2活性测定：采用IL-2依赖细胞CTLL-2活性测定法，参见文献［1］。活性计算公式为：

活性单位 =(样品达 50% 增殖的稀释倍数)/(标准品达 50% 增殖的稀释倍数)×

　　标准品第1孔IL-2活性单位

　　五、免疫组化ABC法及逆转录-PCR检测SKOV3细胞IL-2基因的表达

　　1.ABC法：支持物培养法制备细胞铺片标本，参照随试剂盒提供的操作说明进行ABC染色（试剂盒购于华美公司）。阳性细胞胞浆呈棕色。

　　2.逆转录(RT)-PCR：采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA^［2］，应用mRNA纯化试剂盒(购于Promega公司)分离细胞mRNA，以其为模板合成cDNA第1条链（逆转录试剂盒购于Promega公司）。以逆转录反应产物为模板进行PCR，扩增IL-2、Neo基因mRNA。循环参数：94℃变性1分钟，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环。反应结束后72℃延伸5分钟。

　　六、细胞形态观察

　　制备细胞铺片标本，吉姆萨染色，光镜下观察细胞形态特征。电子显微镜观察收集待测细胞，常规固定，PHILIPS透射与扫描电镜观察。

　　七、测定细胞生长曲线

　　参照李秀森^［3］的方法进行甲基噻唑基四唑(MTT)测定。共测定5天，绘制细胞生长曲线。各组数据进行直线回归分析，求得回归方程，推算细胞倍增时间，进行各组细胞生长曲线斜率差异的显著性检验。

　　八、³H-TdR掺入实验

　　参照文献［1］进行，1×10⁴细胞接种24小时后加入25 μCi/ml　³H-TdR 20μl（中国原子能研究所提供），培养16小时后收集细胞，测定放射强度。

　　九、细胞周期分析

　　收集对数生长期细胞(1～2)×10⁶，于4℃、70％乙醇固定至少24小时。检测前去除固定液，经RNA酶消化，溴化丙锭（Sigma公司产品）避光染色;调整细胞浓度为1×10⁶/ml，经300目尼龙网，上机测定，每个样品测定10 000个细胞。

结果

　　一、携带IL-2基因逆转录病毒载体的构建

　　以质粒pPSRV/IL-2为模板，PCR扩增出IL-2 cDNA功能编码区，长490 bp，与载体pLXSN连接成功，将其命名为pLIL-2SN。

　　二、包装细胞病毒滴度及鉴定

　　转染空载体者病毒滴度最高为3.2×10⁵ CFU/ml，命名该克隆为PA317/Neo，转染pLIL-2SN者病毒最高滴度为1.75×10⁵ CFU/ml，命名该克隆为PA317/IL-2。分别以PA317/IL-2、PA317/Neo细胞染色体基因组DNA为模板，以Neo、IL-2基因引物扩增相应的外源基因，PA317/Neo细胞可扩增出Neo基因，而PA317/IL-2细胞既可扩增出Neo基因片段，又可扩增出IL-2基因片段。

　　三、IL-2基因导入SKOV3细胞及IL-2活性测定

　　命名pLXSN修饰的SKOV3细胞为SKOV3/Neo，pLIL-2SN修饰的SKOV3细胞为SKOV3/IL-2。采用有限稀释法将SKOV3/IL-2细胞单克隆化并扩增，共获得8个单克隆。培养上清液IL-2活性最高者每24小时为318U/10⁶细胞，现已传38代，历时5个月，IL-2表达量下降为每24小时30U/10⁶细胞。ABC法显示SKOV3/IL-2 细胞胞浆呈棕色，为强阳性，有IL-2表达。RT-PCR显示，SKOV3/IL-2、SKOV3/Neo细胞有相应外源基因mRNA的表达。

　　四、IL-2基因转导的SKOV3细胞形态特征

　　光镜下SKOV3细胞具以下特点：细胞密度较大，呈复层性生长，常重叠呈簇状；细胞呈梭形；胞浆蓝染，胞核呈紫红色、空泡状，可见3～5个核仁；核浆比较大，胞核直径常与细胞短径重叠。SKOV3/Neo细胞铺片镜下所见与此相仿，但SKOV3/IL-2细胞却与其有明显的差别：细胞呈单层性生长，分布均匀，密度低于SKOV3；细胞呈圆形，鳞状排列；可见面积为一般细胞2～3倍的细胞；胞浆蓝染，见较多空泡，胞核仍为空泡状，可见2～3个核仁；核浆比亲本细胞及转导空载体细胞减小。核分裂相：SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2细胞平均每个400倍视野的核分裂相出现频率分别为9.0、8.7和1.0，SKOV3/IL-2核分裂相少于亲本细胞和转染空载体细胞(P＜0.01)。

　　电镜下见SKOV3、SKOV3/Neo细胞无明显异常，SKOV3/IL-2细胞质高度空泡化，但是质膜尚完整，线粒体等细胞器界膜完好，线粒体脊结构可辨；空泡化结构呈现不同的发育阶段，部分空泡化结构系从高尔基复合体囊池演变而来；细胞核的变化表现为染色质在核内聚集成巨大的团块；在染色质尚未发生空泡化的细胞中，可见大小不等的脂质样结构，其内可见尚未消化的膜性结构。

　　五、细胞生长曲线

　　SKOV3、SKOV3/Neo生长曲线相伴上升，接种24小时后进入指数生长期。而SKOV3/IL-2细胞生长曲线上升缓慢，48小时后方进入指数生长期；SKOV3、SKOV3/Neo、SKOV3/IL-2 3组细胞对数生长期的倍增时间分别为38.4小时、38.4小时和65.4小时，SKOV3/IL-2细胞生长明显延缓。回归曲线的显著性检验表明，后者增殖幅度较前两者降低，差异有极其显著性(P＜0.001)。

　　六、³H-TdR掺入试验

　　SKOV3、SKOV3/Neo、SKOV3/IL-2 3组细胞³H-TdR掺入量分别为17 322±2 000.7 min^-1、11 680.7±4 133.0 min^-1和8 095.3±2 868.8 min^-1，SKOV3/IL-2的³H-TdR掺入量较SKOV3、SKOV3/Neo分别下降52.3%和36.9%，差异有显著性(P＜0.05)。

　　七、细胞周期分析

　　3组细胞的细胞周期特征见附表。SKOV3/IL-2细胞G₀、G₁期细胞明显多于SKDV3及SKOV3/neo细胞，而S、M期细胞明显少于SKDV3及SKOV3/neo细胞(P＜0.001)。

附表　不同细胞周期3组细胞百分比(%)

　　讨论

　　一、携带人IL-2基因逆转录病毒载体的构建

　　本研究构建了携带人IL-2功能编码区和全长cDNA的逆转录病毒重组载体，将IL-2 cDNA导入卵巢上皮癌细胞系SKOV3，并分别于蛋白质和核酸水平证实了IL-2基因的表达。SKOV3/IL-2细胞已经连续培养5个月，传代38代，SKOV3/IL-2培养液上清液中，仍然可检测到IL-2活性，说明IL-2 cDNA已整合到宿主细胞染色体基因组，可随细胞分裂传递给子代细胞。IL-2分泌细胞的建立，为研究IL-2基因转导对卵巢癌细胞生物学特性的影响，为进而研究IL-2基因转导卵巢癌细胞作为基因修饰肿瘤疫苗用于卵巢癌的预防与治疗，打下了基础。

　　二、IL-2基因转导对SKOV3细胞形态的影响

　　细胞超微结构研究显示，IL-2基因修饰细胞胞质高度空泡化，染色质有一定程度的集聚，提示IL-2基因修饰肿瘤细胞出现凋亡征兆^［4］。凋亡是细胞的正常生理过程，这一生理现象的丧失是肿瘤细胞重要特征之一，某些化疗药物正是通过诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤效应的^［5］。因此，IL-2基因修饰SKOV3细胞凋亡征兆的出现，有可能对SKOV3细胞的增殖和致瘤性产生一定的影响。

　　与亲本细胞相比较，IL-2基因修饰细胞镜下形态主要表现在细胞密度降低、体积增大、形态趋于一致、核浆比缩小。细胞因子基因转导引起细胞形态改变的报道很少，但所引起的细胞形态的改变是确定的^［6］。本研究仅观察了细胞的形态特征，还有待形态计量学方面的研究进一步确认。培养细胞的形态是由多种因素决定的，细胞本身的遗传特性、培养环境及细胞的生长状况等都可影响细胞的形态，当排除诸多外界因素影响之后，细胞自身的遗传特性是决定因素。IL-2基因修饰引起SKOV3细胞形态改变的机理尚不清楚，IL-2基因转导所导致的肿瘤细胞形态的变化，可能预示肿瘤细胞生物学特性的改变，值得深入研究。

　　三、IL-2基因转导对SKOV3细胞增殖的影响及意义

　　一般认为，IL-2基因转导可降低肿瘤细胞的体外增殖能力，但是，这种作用，不同的肿瘤有一定差异^［7］。本研究从多方面研究了IL-2基因转导对卵巢癌细胞系SKOV3体外增殖的影响。细胞生长曲线、对数生长期的倍增时间、³H-TdR掺入、核分裂相等结果表明，SKOV3/IL-2细胞的体外增殖受到了一定程度的抑制；细胞周期分析显示，IL-2基因转导使SKOV3细胞阻滞于细胞周期的G₀、G₁期，S、M期明显减少。而在空载体转导的肿瘤细胞SKOV3/Neo，并没有发现上述改变，说明这一现象的发生与IL-2基因转导有直接的联系。

　　人体是个有机的整体，其细胞数目是相对恒定的，细胞的增殖与死亡始终保持着一种平衡状态，如果这种平衡失调，人体即陷于病理状态。肿瘤就是细胞异常增殖，且得不到有效抑制的结果。无限增殖是肿瘤细胞的重要特征之一，IL-2基因转导使肿瘤细胞增殖受到抑制，提示IL-2基因导入有可能逆转肿瘤细胞恶性表型。IL-2基因是IL-2的编码基因，与肿瘤细胞的增殖无明确关系^［8］。IL-2基因转导使肿瘤细胞的增殖受到抑制，可能与以下因素有关：(1)导入IL-2基因的SKOV3细胞可分泌一定量的IL-2，IL-2可能通过与细胞膜表面CD25结合，抑制肿瘤细胞的增殖^［9］；(2)肿瘤细胞IL-2基因转导可诱导细胞凋亡^［10］；(3)对肿瘤基因表达的影响，癌基因的激活与抑癌基因的失活，是肿瘤细胞恶性增殖的分子基础，c-myc、erb-2/neu及p53等均与肿瘤的增殖密切相关^［11］。

　　IL-2基因转导所致的SKOV3细胞的增殖抑制，说明IL-2基因导入对SKOV3细胞生物学特性的影响是多方面的。靶细胞免疫原性的改变只是IL-2基因转导所引起的肿瘤细胞生物学特性众多改变中的一个方面。目前，常用的间接体内（ex vivo）疗法，不能使IL-2基因转导的疗效得到充分体现，有必要探讨直接体内（in vivo）的治疗方式^［12］。

参考文献

　　1　钱玉昆主编.实用免疫学新技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1994.49-50.

　　2　Sambrook J, Fristsch EF, Maniatis T， eds， 分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫译.第2版.北京：科学出版社，1989.343-392.

　　3　李秀森.MTT比色法在检测细胞和淋巴因子活性中的应用.解放军医学情报，1991，5：240-241.

　　4　Robertson AM, Bird CC, Waddell AU, et al. Morphological aspects of glycocorticoid-induced cell death in human lymphoblastoid cells. J Pathol, 1978, 126:181-187.

　　5　Jhoson DH. Current status of etoposide in the management of small cell lung cancer. Cancer, 1991, 67:231-244.

　　6　Tamm I, Cardinale I, Krueger J, et al. Interleukin 6 decreases cell-cell association and increases motility of ductal breast carcinoma cells. J Exp Med, 1989,170:1649-1669.

　　7　Schmidt-Wolf GD, Schmidt-Wolf IGH. Cytokines and gene therapy. Immunol Today， 1995, 16: 173-175.

　　8　周廷冲主编.多肽生长因子基础与临床. 北京：中国科技出版社，1992.268-279.

　　9　Yasumura S, Lin WC, Weidmann E, et al. Expression of interleukin 2 receptors on human carcinoma cell lines and tumor growth inhibition by interleukin 2. Int J Cancer, 1994,59:225-234.

　　10　郭宁，李秀森，刘晓丹，等.人白细胞介素2基因修饰的肥大细胞瘤广泛凋亡.中国病理生理学杂志，1996，25：284－287.

　　11　Demczuk S. Oncogenes: a review of their cilinical application. Crit Rev Oncol/Hemato， 1991, 11: 209-239.

　　12　Lattime EC, Lee SS, Eisenlohr LC, et al. In situ cytokine gene trasfection using vaccinia virus vectors. Semin Oncol, 1996, 23: 88-100.

(收稿：1997-10-08　　修回：1998-06-25)