卵巢癌抗独特型抗体6B11scFv和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的构建和表达

中华妇产科杂志 1999年第7期第34卷 论著

作者：杨飞雪　钱和年　黄华梁　冯捷　崔恒

单位：杨飞雪　钱和年　冯捷　崔恒　北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心　100034；黄华梁　中国科学院遗传所

关键词：重组融合蛋白质类；抗体；抗独特型；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；卵巢肿瘤

　　【摘要】　目的　构建和表达模拟人卵巢癌抗原的抗独特型单链抗体6B11scFv 和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)的融合蛋白,以提高抗独特型抗体的免疫原性,为进一步用于卵巢癌的免疫治疗提供基础。方法　采用基因工程技术，用编码连接肽的DNA连接6B11scFv和hGM-CSF cDNA，并对大肠杆菌用温度进行诱导表达；采用蛋白免疫吸附印迹法，对表达的蛋白进行活性测定。结果　表达的蛋白能分别与6B11的初始抗体和小鼠抗hGM-CSF单克隆抗体特异结合。结论　表达的融合蛋白保留了6B11scFv和hGM-CSF两种成分的活性，增强了6B11scFv的免疫原性。

The Construction and Expression of 6B11scFv Anti-idiotypic Antibody and Human Granulocyte-macrophage -colony Stimulating Factor in Escherichia Coli

YANG Feixue, QIAN Henian, HUANG Hualiang, et al.

Gynecologic Oncology Center, People′s Hospital, Bejing Medical University, Beijing 100034

　　【Abstract】　Objective　To enhance the antigenicity of an anti-idiotypic single chain antibody 6B11 mimicking ovarian cancer antigen. Methods　Using DNA recombinant technique, a recombinant fusion protein expression vector was constructed. This vector linked 6B11scFv cDNA and human GM-CSF with a linker. Protein productions were induced with the temperature change in E. Coli and analyzed with western blot.Results　The expressed fusion protein can be reacted with both anti-human antibody and COC166-9(AB1 of 6B11).Conclusion The recombinant fusion protein keeps the activities of both components and may be used as tumor vaccine for ovarian cancer.

　　【Key words】　 Recombinant fusion proteins　　Antibodies, anti-idiotypic　　Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor　　Ovarian neoplasms

　　肿瘤的主动免疫治疗，越来越多的受到关注。但目前对肿瘤特异性抗原了解的并不多，而机体对肿瘤相关抗原往往处于免疫耐受状态。抗独特型抗体能够模拟外来抗原，并且能够打破机体的免疫耐受，作为肿瘤疫苗，已有用于肿瘤治疗的报道，并取得了良好疗效^［1-3］，具有良好的应用前景。但由于抗独特型抗体只模拟抗原的单个表位，引起的免疫反应容量小，免疫原性弱。而且目前常用的单克隆抗体是鼠源性，其缺点是由于种属特异性，反复用于人体可导致产生人抗鼠抗体，严重时可出现类似血清病样反应，限制了其在临床的应用。北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心(妇科肿瘤中心)制备了模拟卵巢浆液性乳头状囊腺癌抗原的抗独特型抗体6B11和6B11单链抗体6B11scFv^［4,5］。为了进一步提高单链抗体表达原，我们构建了单链抗体和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)融合蛋白，以增强6B11scFv的免疫原性,为用作肿瘤疫苗提供基础。

　　 材料和方法

　　一、质粒和菌株

　　质粒pCANTAB5E-6B11scFv为妇科肿瘤中心构建，含6B11scFvcDNA^［4］；质粒PBV221-GM-CSF由中国科学院微生物所丘并生研究员提供，内含hGM-CSF cDNA；表达载体pKpL-3a及大肠杆菌pop2136由北京医科大学马大龙教授提供；质粒pUC18购自北京华美生物制品公司。

　　二、限制性内切酶和工具酶

　　内切酶NcoⅠ、 XbaⅠ、 BglⅡ为中国医学科学院基础所产品；SpeⅠ、 BamHⅠ、 ApaⅠ及工具酶T4 DNA Ligase、 Taq DNA Polymerase、 Klenow 均为美国Promega公司产品；T7测序盒为瑞典Pharmacia公司产品。

　　三、连接肽DNA和引物

　　连接肽DNA和引物均由美国赛百盛公司合成。连接肽DNA编码13个氨基酸，为甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的重复序列。6B11scFv的上游引物为：5′-CGCCATGGGACAGGTCAAACTGCAGGAGTC-3′，下游引物为5′-CGGGATCCCCGTTTTTATTTCCAACTTT- GTCC-3′，扩增片段760bp；GM-CSF上游引物为：5′ -GCACTAGTGCACCGGCCCGCTCTCTCCGAG-3′，下游引物为：5′-GCTCTAGATCACTCCCTGGACTGGCTCCC-3′,扩增的片段约为380 bp。

　　四、抗体

　　COC166-9单克隆抗体(单抗)，为妇科肿瘤中心制备，是6B11的初始抗体。小鼠抗人hGM-CSF单抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自军事医学科学院。

　　五、6B11scFv和hGM-CSF融合蛋白表达载体的构建

　　1．聚合酶链反应(PCR)扩增6B11scFv和hGM-CSF cDNA片段：PCR反应条件均为变性94℃30秒，退火60℃30秒，延伸72℃90秒，扩增30次循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收，并用 Klenow酶修平。

　　2．表达载体的构建：先对载体进行改造，插入连接肽序列和酶切位点NcoⅠ、 BamHⅠ、 SpeⅠ、XbaⅠ，改建的载体命名为pKPL-r。再分别在连接肽序列的两端插入6B11scFv(NcoⅠ与BamHⅠ之间)和hGM-CSF(SpeⅠ与XbaⅠ之间)PCR扩增片断。表达载体命名为pL6B11GM。应用基因内部和载体上的酶切点对表达载体进行鉴定。将融合基因克隆到pUC18，按T7测序盒的说明进行序列测定。

　　六、诱导表达

　　重组表达载体转入大肠杆菌pop2136，选取单菌落。用温度变化进行诱导表达，42℃诱导4小时后，取1 ml菌液，高速短暂离心。沉淀物进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)考马斯亮蓝染色，观察新增加的条带及表达量。

　　七、蛋白免疫印迹分析

　　上述样品经SDS-PAGE电泳后，在Bio-Rad转膜仪上转至硝酸纤维素膜。一抗分别加COC166-9和小鼠抗人hGM-CSF单抗，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，以DAB显色。

　　结果

　　一、PCR扩增6B11scFv和hGM-CSF

　　PCR经30次循环后，扩增产物1％琼脂凝胶电泳，在760 bp和380 bp处可见特异扩增条带，符合 6B11scFv和hGM-CSF的cDNA长度(图1,2)。

1：Phi 174/Hae Ⅱ标记

　　2： 6B11scFv PCR产物

　　3： 阴性对照

　　图1　6B11scFv PCR扩增产物电泳图

1、2、4、5：hGM-CSF PCR产物　3：Phi 174/Hae Ⅱ　标记　6：阴性对照

　　图2　hGM-CSF PCR扩增产物电泳图

　　二、表达载体的酶切鉴定和序列测定

　　表达载体经基因内部和载体上的内切酶进行鉴定。BglⅡ酶切位点位于6B11scFv,ApaⅠ位点位于hGM-CSF，载体上没有这两个酶切位点重组表达载体能被BglⅡ、ApaⅠ酶切，说明目的基因已插入载体。序列分析采用了手工测序，经读片重组载体中6B11scFv和hGM-CSF与原序列一致，连接肽与设计一致，连接方向和读码框架正确。

　　三、诱导表达

　　42℃诱导4小时后，SDS-PAGE分析结果表明,　与不含载体的pop2136和含空载体pKPL3-r的pop2136比较，含pL6B11GM的pop2136在43kd处出现新增加条带，符合融合蛋白理论推算的相对分子质量（融合基因为1.2kb,编码的蛋白相对分子质量为43 000）。表达量约为1％（图3）。

　　四、蛋白免疫印迹分析

　　COC166-9和小鼠抗人hGM-CSF单克隆抗体均能在43kb处检测到特异的蛋白带，说明融合蛋白保留了6B11和hGM-CSF的免疫学活性（图4）。

1：低分子质量标记　2：pop2136诱导前　3：pop2136/pKPL-r诱导前　4：pop2136/pL6B11 GM诱导前　5、6：pop2136 42诱导3、4小时 　7、8： pop2136/pKPL-r诱导3、4小时　 9、10： pop2136/pL6B11GM诱导3、4小时

　　图3　pop2136/pL6B11GM诱导表达的SDS-PAGE鉴定电泳图

1： 低分子质量蛋白标记　2： pKPL-r(COC166-9检测)　3： pL6B11GM(COC166-9检测)　4：pKPL-r(小鼠抗人hGM-CSF单抗检测)　5： pL6B11GM(小鼠　　　　　　抗人hGM-CSF单抗检测)

　　图4　pL6B11GM表达产物蛋白免疫印迹分析

　　 讨论

　　妇科肿瘤中心在国内首先制备了卵巢癌抗独特型抗体6B11，并在动物实验中能够诱导特异性体液和细胞免疫反应。但由于为鼠源性，限制了在临床的应用。为了克服这一缺点，又克隆并构建了单链抗体，减少了其种属特异性。为更好地用于临床，有必要提高单链抗体的免疫原性。

　　目前，常用来增加抗原免疫原性的方法是与钥孔戚血蓝素偶联，并与免疫佐剂联合应用。由于常用佐剂对人体有毒害作用，有许多研究正致力于新型佐剂的应用。细胞因子作为佐剂受到越来越多的重视，尤其在肿瘤疫苗中的应用。hGM-CSF能够促进抗原呈递细胞(antigen presenting cell, APC)分化成熟，表达MHCⅡ类分子，加强细胞和体液免疫，是极有前景的疫苗佐剂^［6］。有文献报道，hGM-CSF与抗原的融合蛋白能明显增加抗原的免疫原性^［7］。

　　重组融合蛋白是通过DNA重组的方法，将功能上相关的两种蛋白用连接肽连接，以达到优化蛋白功能的目的，如免疫毒素和细胞因子融合蛋白^［8，9］，并已用于肿瘤治疗，但尚未见细胞因子与抗独特型抗体融合蛋白的报道。融合蛋白的构建中，连接肽的选择对保留每种成分的活性有重要意义。连接肽应选用非极性的疏水氨基酸，长度在10～15个氨基酸之间，能使两种分子形成保持活性必需的空间构象。我们在构建融合蛋白时，选用了通用连接肽即甘氨酸和丝氨酸的重复序列。表达的蛋白能与COC166-9和hGM-CSF抗体结合，说明保留了6B11sc Fv和hGM-CSF两种成分的活性。6B11scFv已去除了Fc段，大大减低了其鼠源性，而hGM-CSF是人源性，为临床应用奠定了基础。目前，高效表达和功能的研究正在妇科肿瘤中心继续进行。

　　本课题受国家自然科学基金资助(基金编号：39670775)

　　 参考文献

　　1　Fagerberg J, Hjelm AL, Ragharnner P, et al. Tumor regression in monoclonal antibody-treated patients correlates with the presence of anti-idiotypic T lymphocytes. Cancer Research, 1995, 55: 1824-1827.

　　2　Fagerberg J, Sternitz M, Wigzell H, et al. Human anti-idiotypic antibodies induced a humoral and celluar response against a colorec tal carcinoma-associated antigen in patients. Proc Natl Acad Sci USA， 1995, 92: 4773-4777.

　　3　Pervin S, Chakraborty M, B-chattejee M, et al. Induction of antitumor immunity by an anti-antiidiotype antibody mimicking carcinoembryonoc antigen. Cancer Research, 1997, 57:728-734.

　　4　Qian HN, Lu WY. Anti-idiotypic monoclonal antibodies aganist anti-ovarian monoclonal antibody COC166-9: generation and application. CMJ, 1994, 107: 99-103.

　　5　张香云，钱和年，丘并生, 等. 6B11卵巢癌抗独特型单链抗体表达及序列分析.北京医科大学学报，1996，28：5-8.

　　6　Jaffee EM, Thomas MC, Huang AYC, et al. Enhanced immune priming with spatial distribution of paracrine cytokine vaccines. J Immunol, 1996, 19: 176-183.

　　7　Tao MH, Levy R. Idiotypic/granulocyte-macrophage colony stimulating factor fusion protein as vaccine for B-cell lymphona. Nature, 1993, 362: 755-758.

　　8　Pancook JD, Bercker JC, Reisfed RA, et al. Eradication of established hepatic human neuroblastoma metastases in mice with severe combined immunodeficiency. Cancer Imunol Immunother, 1996, 42: 88-92.

　　9　Demon MJ, Page M. Activation of methotrexate-phenylalanine by monoclonal antibody-carboxypeptedase A conjugate for the specific treatment of ovarian cancer in vitro. Br J Cancer, 1996, 73: 281-287.

(收稿：1998-01-12　　修回：1998-12-23)