雌激素与孕激素对卵巢癌耐药细胞系OVCAR-3生长及耐药的影响

中华妇产科杂志 1999年第11期第34卷 论著

作者：孟君艳　　尤宗兵　　郭燕燕

单位：孟君艳　100034 北京医科大学第一医院妇产科；尤宗兵，郭燕燕　现在航天部七一一医院妇产科

关键词：雌激素类；甲羟孕酮卵巢肿瘤；肿瘤细胞；培养的；抗药性；肿瘤

　　【摘要】　目的　研究雌、孕激素对卵巢癌耐药细胞系OVCAR-3生长及对阿霉素（ADM）耐药的影响。方法　用四甲基偶氮唑蓝（MTT）快速比色法， 计算细胞生存率，以比较不同浓度雌、孕激素对细胞生长的影响，及雌、孕激素与异搏定对卵巢癌耐药细胞系OVCAR-3耐药性的影响。结果　高浓度的苯甲酸雌二醇（E₂，10.00～100.00 μmol/L)和安宫黄体酮（MPA，100.00 μmol/L)可抑制OVCAR-3细胞的生长，且二者联合抑制作用增强；而较低浓度的E₂(0.01～1.00 μmol/L)和MPA(0.01～10.00 μmol/L)对该细胞的生长无明显影响；异搏定可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，即逆转该细胞对ADM 的耐药；E₂或MPA均可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，即逆转该细胞对ADM的耐药，且其作用强于异搏定。 结论　超生理浓度的雌、孕激素可抑制OVCAR-3细胞的生长，而较低浓度的雌、孕激素对其生长无影响；雌、孕激素可逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，且作用强于异搏定，可望成为临床化疗的辅助用药。

Effects of Estradiol and Medroxyprogesterone on the Growth and Doxorubin-resistance of Drug-resistant

　　Human Epithelial Ovarian Cancer Cell Line OVCAR-3

　　MENG Junyan^*, YOU Zongbing, GUO Yanyan.　^*

　　711 Hospital of China Areospace Corporation, Beijing 100034

　　【Abstract】　Objective　To study the effects of estradiol (E₂) and medroxyprogesterone acetate (MPA) on the growth of drug resistant human epithelial ovarian cancer cell line. Methods　OVCAR-3 cells, treated by different concentrations of E₂, MPA and verapamil, were examined for their growth inhibitions with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT, a tetrazolium dye) rapid photocolorimetric assay. Results　OVCAR-3 cell growth was inhibited by E₂ at high concentrations (10.00～100.00 μmol/L)and by MPA at 100.00 μmol/L, while lower concentrations of E₂(0.01～1.00 μmol/L) and MPA(0.01～10.00 μmol/L) had no effect on OVCAR-3 cell growth, neither stimulation nor inhibition. The effect of E₂ combined with MPA was more obvious than either one used separately. E₂ and MPA in combination with doxorubin showed a synergistic inhibition effect on OVCAR-3 cell growth, which suggested that both of them could reverse the doxorubin resistance of OVCAR-3 cell line. The inhibition effect of Verapamil combined with doxorubin was obviously weaker than that of E₂ and MPA. Conclusions　E₂ and MPA could reverse the doxorubin resistance of OVCAR-3 cell line and their inhibition were more obvious than that of verapamil, which suggested that E₂ and MPA may be used clinically for adjuvant chemotherapy.

　　【Key words】　Estrogens　　Medroxyprogesterone　　 Ovarian neoplasms 　　Tumor cell, culturedDrug resistance neoplasm

　　肿瘤细胞减灭术及术后化学治疗（化疗），是目前治疗卵巢癌的主要手段，但化疗的耐药问题严重影响了化疗的效果。近年来研究认为，多药耐药基因MDR1及其编码的P-糖蛋白介导的多药耐药，是化疗耐药的主要机理之一，并发现一些药物如异搏定、奎尼丁、环孢霉素A等，可逆转其介导的多药耐药^［1］ 。但这些药物的毒副作用较大，限制了临床应用。又有研究发现，孕酮可逆转P-糖蛋白介导的耐药，且其作用强于异搏定^［2］。OVCAR-3卵巢癌细胞系是体外培养的对顺铂、阿霉素（ADM）、环磷酰胺等多种药物耐药的多药耐药细胞系。本研究对雌、孕激素对OVCAR-3细胞生长的影响，及能否逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，进行了初步的探讨。

　　材料和方法

　　一、材料

　　苯甲酸雌二醇（E₂）、安宫黄体酮（MPA）、盐酸维拉帕米(异搏定)均为化学对照品，来自中国药品生物制品检定所；ADM为汕头明治医药有限公司产品；四甲基偶氮唑蓝(MTT)为德国Serva公司产品；OVCAR-3细胞自美国标准细胞库引进。

　　二、 方法

　　1.细胞的制备：OVCAR-3细胞在培养液(含10%小牛血清的RPMI-1640培养基)中培养至对数生长期，消化、过滤制成单细胞悬液，稀释至3×10⁵个细胞/ml，混匀后加入96孔细胞培养板，每孔100 μl，于37℃、5%二氧化碳培养箱培养18小时，吸弃上清液。

　　2.分组及细胞培养：将96孔培养板按列分组，每组8孔，第一组不加细胞，作为空白对照；一组为对照组，每孔加入不含药培养液200 μl。其余各组为实验组，每孔分别加入200 μl新鲜配制的不同浓度（即终浓度分别为0.01 μmol/L、 0.10 μmol/L、1.00 μmol/L、 10.00 μmol/L、50.00 μmol/L、100.00 μmol/L）的含药（E₂、MPA、E₂＋MPA）培养液（研究对耐药的影响时，每组均加入终浓度为10.00 μmol/L的ADM，包括对照组）。继续培养48小时，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，再培养4小时；吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜溶液200 μl (包括空白对照孔)，混匀，使之彻底溶解，于30分钟内，以酶标仪测波长为600 nm处的吸光度值（以空白对照孔为零）。

　　3．细胞生存率：细胞生存率＝(实验组吸光度平均值/对照组吸光度平均值)×100％（以对照组生存率为100％）；或细胞生存率＝［实验组吸光度平均值/（对照组吸光度平均值÷50％)］×100％（研究对耐药的影响时，以对照组即只加ADM的生存率为50％，因预试验测得ADM浓度为10μmol/L时细胞生存率约50％）。

　　三、 统计学处理

　　本研究结果采用Gpis 1.12统计软件，计算各组吸光度(±s)与对照组两两进行t检验。以Microsoft excel 97软件制图。

　　结果

　　一、 雌、孕激素对OVCAR-3细胞生长的作用

　　1. E₂对OVCAR-3细胞生长的作用: E₂浓度为0.01～1.00μmol/L时，OVCAR-3细胞生存率为101.0%～102.5%，与对照组生存率100.0%比较，差异无显著性 (P＞0.05)。E₂浓度10.00～100.00 μmol/L时，OVCAR-3细胞生存率为87.5%～65.9%,细胞生长受到抑制，与对照组比较，差异有显著性(P＜0.05及P＜0.01)。见表1。

　　2. MPA对OVCAR-3细胞生长的作用:MPA浓度为0.01～10.00μmol/L时，细胞生存为98.7%～101.6%，与对照组生存率100.0%比较，差异无显著性 (P＞0.05)。MPA浓度为50.00μmol/L时，细胞生存率为92.9%,细胞生长受到轻度抑制，但与对照组比较，差异无显著性(P＞0.05)。MPA浓度为100.00μmol/L时，细胞生存率为36.5%,细胞生长受到明显抑制，与对照组比较，差异有极显著性(P＜0.01)。见表1。

表1　两组E₂ 、MPA及E₂ +MPA对OVCAR-3细胞生长的影响

　　注：以上结果均为两次实验的细胞生存率的平均值， 对照组生存率为100%。^*与对照组比较， P＜0.05；^** 与对照组比较， P＜0.01

　　3. E₂和MPA联合对OVCAR-3细胞生长的作用:E₂和MPA联合应用，浓度0.01～1.00 μmol/L时，细胞生存率为100.7%～102.1%，与对照组生存率100.0%比较，差异无显著性(P＞0.05)；浓度为10.00 μmol/L时，细胞生存率为89.7%，细胞生长受到轻度抑制，但与对照组比较，差异无显著性(P＞0.05)；浓度为50.00～100.00 μmol/L时，细胞生存率为54.3%～28.7%, 细胞生长受到明显抑制，与对照组比较, 差异有极显著性(P＜0.01)。见表1。

　　二、 雌、孕激素及异搏定对OVCAR-3细胞对ADM耐药的作用

　　1. E₂对OVCAR-3细胞的ADM耐药对作用：E₂浓度为0.01～10.00 μmol/L时,细胞生存率为51.7%～45.7%，与对照组即单加ADM组生存率50.0%比较,差异无显著性(P＞0.05)；浓度为50.00～100.00 μmol/L时，细胞生存率为39.1%～19.3%，可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，与单加ADM组比较，差异有极显著性(P＜0.01)。见表2。

表2　不同浓度 E₂ 、MPA及异搏定对

　　OVCAR-3细胞对ADM耐药的影响

　　 注：以上结果均为两次实验的细胞生存率的平均值， 单加ADM组的细胞生存率为50%，ADM浓度均为10μmol/L。^* 与单加ADM组比较， P＜0.05；^** 与单加ADM比较， P＜0.01

　　2. MPA对OVCAR-3细胞对ADM耐药的作用：MPA浓度为0.01～10.00μmol/L时，细胞生存率为49.3%～51.8%，与对照组即单加ADM组生存率50.0%比较，差异无显著性(P＞0.05)；浓度50.00～100.00 μmol/L时，细胞生存率为31.4%～11.0%，均可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，与单加ADM组相比较，差异有极显著性(P＜0.001)，MPA的作用稍强于E₂。见表2。

　　3. 异搏定对OVCAR-3细胞对ADM耐药的作用：异搏定浓度为0.01～1.00 μmol/L时细胞生存率为50.2%～51.2%，与对照组即单加ADM组生存率50.0%比较,差异无显著性(P＞0.05)；浓度为10.00 μmol/L时，细胞生存率为45.8%,可轻度增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，与单加ADM组比较，差异有显著性(P＜0.05)；浓度为50.00～100.00 μmol/L时，细胞生存率为41.1%～33.9%,可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，与单加ADM组比较，差异有极显著性(P＜0.01)，但作用程度低于同浓度的E₂或MPA的作用。见表2，图1。

图1　异搏定与E₂及MPA对OVCAR-3细胞对ADM耐药的

　　作用比较， 各组ADM浓度均为10.00 μmol/L

　　讨论

　　一、 雌、孕激素对OVCAR-3细胞生长的影响

　　本研究结果显示， E₂浓度为0.01～1.00 μmol/L时，对OVCAR-3细胞生长无明显影响，这与一些研究中雌激素可促进细胞生长的结果不一致。据Langdon等^［3］的研究显示，对于含较高的雌激素受体（ER）水平（112 fmol/mg胞浆蛋白）的细胞系PEO4，雌激素可促进其生长，而对未检测出ER的PEO4细胞的生长则无影响。因此，此结果可能与OVCAR-3细胞中ER含量相对较少（28fmol/mg胞浆蛋白^［4］）有关。本研究中E₂在超生理浓度(10～100.00 μmol/L)下对OVCAR-3细胞生长有抑制作用，这与戴建瑜等^［5］的结果一致，这可能是通过某种受体外机理如调节一些转化因子的分泌^［5］，直接影响细胞代谢而起作用的。

　　对孕激素与卵巢癌细胞生长的关系的研究结果趋于一致，即孕激素对卵巢癌细胞有剂量依赖抑制作用，其中以天然孕酮作用更为明显^［6］ 。本研究中，MPA浓度为0.01～50.00 μmol/L时，对OVCAR-3细胞生长无显著影响，在100.00μmol/L时才显著抑制OVCAR-3细胞生长，这可能与OVCAR-3细胞缺乏孕激素受体(PR)有关^［4］。而MPA在高浓度表现的抑制作用，也可能是通过某种受体外机理起作用的。

　　根据Hamilton等^［7］的研究，雌激素可诱导OVCAR- 3细胞的PR的表达。其他学者也证实E₂有诱导PR表达的作用^［8］ 。这可能是本研究中E₂和MPA联合应用抑制作用明显增强的原因。提示在一些缺乏PR表达卵巢癌的治疗中，可考虑应用雌激素以增加PR表达，提高孕激素的疗效。

　　二、雌、孕激素与异搏定对OVCAR-3细胞对ADM耐药的影响

　　本研究结果显示，在50 μmol/L浓度时，MPA对细胞生长无明显影响，与ADM合用却可明显增强ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，提示MPA可逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药。此结果与国外一些有关研究是一致的^［2］。本研究中，E₂也可增强ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，提示E₂也可逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，并且其作用仅稍弱于MPA。

　　异搏定是目前公认的有效的耐药修饰剂，可逆转多药耐药基因MDR1及其编码的P-糖蛋白介导的多药耐药。本研究显示，异搏定可增强ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，即逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，但其作用弱于同浓度的雌、孕激素，此结果与国外一些有关研究是一致的^［2］。异搏定逆转耐药的作用弱于MPA的原因可能如下：（1）据报道，小鼠多药耐药细胞中有两种多药耐药基因，即MDR1a和MDR1b，孕酮与MDR1b基因产物的结合明显多于MDR1a，而异搏定则无此特性^［9］。且据近些年的研究报道，人类MDR1基因产物Pgp也有两个不同的结合区^［10］。故在此细胞MPA与异搏定调节耐药的差异可能是由于两者与Pgp结合的位点不同。（2）虽然ADM耐药机理以Pgp介导的多药耐药机理为主，但在OVCAR-3细胞，也可能同时存在其他耐药机理，MPA也可能通过影响其他耐药机理起作用。

　　本研究结果显示，超生理浓度的雌、孕激素可抑制OVCAR-3细胞的生长，而稍低浓度的雌、孕激素对其生长无影响；雌、孕激素可逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，且作用强于异搏定，提示E₂及MPA是有效的耐药修饰剂，并且相对细胞毒性小，可望成为临床化疗的辅助用药。

　　本课题为卫生部基金资助项目（课题编号：96-1-280）

　　参考文献

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(收稿：1999-03-06　　修回：1999-08-23)