顺铂、维拉帕米和环孢菌素诱导卵巢癌细胞凋亡的研究

中华妇产科杂志 2000年第2期第35卷 论著

作者：廖美焱　陈惠祯　水华　胡杰　杨庆忆　邱慧玲　陈红

单位：廖美焱（430071　武汉，湖北医科大学附属第二医院肿瘤影像中心）；陈惠祯（430071　武汉，湖北医科大学附属第二医院肿瘤科）；胡杰（430071 武汉，湖北医科大学附属第二医院肿瘤科）；杨庆忆（430071 武汉，湖北医科大学附属第二医院肿瘤科）；陈红（430071 武汉，湖北医科大学附属第二医院肿瘤科）；水华（430071 武汉，湖北医科大学附属第二医院内科）；邱慧玲（解放军第一七四医院妇产科）

关键词：卵巢肿瘤；脱噬作用；抗药性；顺铂；维拉帕米

　　摘　要：目的　探讨顺铂(DDP)、维拉帕米(VP)及3′-酮基-去甲基苏氨酸1-缬氨酸2-环孢菌素(PSC 833)诱导卵巢癌细胞凋亡的作用机理。方法　以人卵巢癌亲代细胞株 COC₁及其耐DDP亚细胞株COC₁/DDP为材料，根据所加药物的不同分为DDP组、VP组、PSC 833组、DDP联合VP组、DDP联合PSC 833组和对照组，计算各组细胞生长抑制率、细胞凋亡率同时进行细胞周期分析。结果　DDP联合VP组和DDP联合PSC 833组COC₁、COC₁/DDP的细胞生长抑制率均增高，两组COC₁的细胞生长抑制率分别为48.56%和47.86%、两组COC₁/DDP的细胞生长抑制率分别为39.47%和37.81%，量效曲线均下移，两组分别与DDP组比较，差异均有显著性（P＜0.05）。DDP引起S期细胞比例增高，当DDP浓度为1.0 μg/ml时，COC₁ 细胞S期比例最高达99.67％，而DDP浓度为2.0 μg/ml时，S期比例最低降至33.61％,S期细胞大量凋亡；COC₁、COC₁/DDP的细胞凋亡率不同，DDP（0.5～2.0 μg/ml）+PSC 833（0.30 μg/ml）时的细胞凋亡率明显提高，与对照组比较,差异均有显著性（P均＜0.05）。结论　VP、PSC 833有增敏作用，PSC 833能增强DDP诱导COC₁/DDP细胞凋亡的作用。诱导细胞凋亡是DDP作用于COC₁、COC₁/DDP细胞的机理之一，获得性耐药与细胞凋亡耐受有关。

　　Apotosis Induced by Cisplatin and Verapamil or SDZ PSC 833 in Human Ovarian Cell Lines

LIAO Meiyan　CHEN Huizhen　SHUI Hua　et al

　　（Department of Oncology, Second Affiliated Hospital，Hubei Medical University，Wuhan　430071, China）

　　 Abstract：Objective　To study the pharmaceutical mechanisms of cisplatin(DDP), verapamil(VP) and SDZ PSC833, and the mechanism of developing acquired drug resistance. Methods　Two ovarian carcinoma cell lines——one sensitive (COC₁) and the other resistant (COC₁/DDP) to cisplatin were used in this study. The cell viability was measured by trypan blue dye exclusion assay. The apopotic cells were observed and distinguished by light and electron microscopy, and comet assay. Flow cytometry was used to measure the cell cycle. Six groups were set up according to drug(s) delivered: DDP, VP, SDZ PSC833, DDP and VP, DDP and SDZ PSC833, and control group. Results　(1) VP or SDZ PSC833 enhanced cytotoxicity of DDP (q＞1, P＜0.01). (2)The most prominent effect of DDP on cell cycle kinetics was a slowdown in S-phase transit during which cells undergo apoptosis (P＜0.05). (3) COC₁ and COC₁/DDP cells had different rates of apoptosis when DDP added. SDZ PSC833 enhanced apoptosis of COC₁/DDP cells induced by DDP. Conclusions　VP and SDZ PSC833 increase sensitivity of the cell lines to DDP. SDZ PSC833 enhances apoptosis induced by DDP.Induction of apoptosis is one of the pharmaceutical mechanisms of DDP, and acquired drug resistance is associated with resistance to apoptosis. The most prominent effect of DDP on cell cycle kinetics is a slowdown in S-phase transit and apoptotic cells are at S-phase.

　　 Key words：Ovarian neoplasms;　Apoptosis;　Drug resistance;　 Cisplatin; 　Rerapamil▲

　　细胞凋亡是一种生化和形态特征明确的细胞死亡方式。对许多肿瘤的研究表明，细胞凋亡是一种化学治疗（化疗）后普遍存在和至关重要的细胞死亡方式。顺铂（DDP）是卵巢癌化疗常用药物，近年来，大量的资料显示，癌细胞对顺铂的敏感性与细胞凋亡有关，顺铂可诱导卵巢癌细胞发生凋亡。研究顺铂的一些增敏剂发现，增敏剂也与细胞凋亡有关。本研究以卵巢癌亲代细胞株COC₁、获得性耐药株COC₁/DDP为实验对象，初步探讨顺铂、维拉帕米(Verapamil,VP)及3′-酮基-去甲基苏氨酸1-缬氨酸2-环孢菌素(PSC833)与卵巢癌细胞凋亡的关系及其作用机理。

　　资料和方法

　　一、材料

　　1.细胞株：COC₁由中国医学科学院肿瘤研究所建株；COC₁/DDP由湖北医科大学肿瘤研究所建株,耐药倍数为亲代的6.5倍^［1］。

　　2.主要药品：顺铂为中国齐鲁制药厂产品；PSC833为瑞士Sandoz公司产品；VP、低溶点琼脂糖、溴乙锭为美国Sigma公司产品。

　　二、方法

　　1.细胞培养：COC₁、COC₁/DDP细胞用RPMI-1640培养液培养，当细胞数增至1×10⁶/ml时分组加药进行试验，24h后检测。具体步骤如下：在96孔微培养板内，每孔加5×10⁴个细胞培养30min，3个孔为1组。根据所加药物的不同分为，(1)DDP组（0.13、0.25、0.50、1.00、2.00μg/ml）；(2)VP组（0.38、0.75、1.50、3.00μg/ml）；(3)PSC833组（0.15、0.30、0.60、1.20μg/ml）；(4)DDP(0.13～2.00μg/ml)联合VP(3.00μg/ml)组；(5)DDP(0.13～2.00μg/ml)联合PSC833（0.30μg/ml)组；(6)对照组（生理盐水）。

　　2.细胞生长检测：将各组细胞培养24h后，加入等量0.2％台盼蓝染色，镜下计数活细胞，重复3次，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(R)＝［（对照组活细胞-实验组活细胞）／对照组活细胞］×100％。q值^［3］计算公式为:q＝（R_DDP＋R_VP或PSC833）/［R_DDP＋（1-R_DDP）·R_VP或PSC833］。q＞1为协同作用，q＜1为拮抗作用。

　　3.细胞周期分析：采用流式细胞仪（美国BC公司生产的FACS420型）进行细胞周期分析。将各组细胞样品置-20℃，70％乙醇固定，常规预处理后进行细胞周期检测^［8］，各组测10000个细胞。细胞周期计算，应用细胞周期拟合软件(ModfitLT软件)进行。

　　4.凋亡细胞检测：采用“慧星”分析(Comet分析)^［4］方法检测。将各组单细胞悬液与1％低溶点琼脂糖混合成浓度为0.75％的细胞混合液,迅速冷却制成胶冻玻片,碱性溶解、解旋;用低压短时碱性电泳，溴乙锭染色；分别用光学显微镜、电子显微镜、荧光显微镜(日本Olympus公司生产HB-Ⅱ型)和流式细胞仪观察凋亡细胞。判断标准：（1）光学显微镜下，见凋亡细胞体积缩小、细胞浆浓缩、核染色质密度增高、核边聚、核碎裂、细胞膜出现皱褶伴有出泡现象；（2）电子显微镜下，见凋亡细胞核浓缩、边聚，细胞浆内可见完整的细胞器；（3）荧光显微镜下，见DNA染色为桔黄色,凋亡细胞DNA片断向正极方向运动,未受损DNA大分子无明显运动；（4）在流式细胞仪的光散射图谱上，前向光散射与细胞大小有关，侧向光散射与细胞内粒子性质有关，凋亡细胞出现低于正常的前向光散射和较高的侧向光散射。细胞凋亡率＝(凋亡细胞数/总细胞数)×100％,计数300个细胞。

　　三、统计学方法

　　采用χ²检验。

　　结果

　　一、VP、PSC833对DDP的增敏作用

　　VP组和PSC833组，COC₁、COC₁/DDP的生长抑制率均不超过4.00％。预实验结果显示，DDP(0.13～2.00μg/ml)联用浓度为3.00μg/ml的VP或0.30μg/ml的PSC833时，两者量效曲线最为接近,且最高细胞抑制率在50％左右。因此，本研究选择VP浓度3.00μg/ml、PSC833浓度0.30μg/ml作为增敏实验剂量。DDP组细胞抑制率随DDP浓度升高而升高，呈剂量依赖性，COC₁、COC₁/DDP的细胞抑制率分别由4.55％升至43.58％、0.18升至21.25％。DDP联合VP组的量效曲线下移，COC₁、COC₁/DDP的细胞抑制率分别由14.53%升至48.56%、8.80％升至39.47％。DDP联合PSC833组，COC₁、COC₁/DDP的细胞抑制率分别由9.85％升至47.86％、3.48％升至37.81％。DDP联合VP组、DDP联合PSC833组的细胞生长抑制率，分别与DDP组比较，差异均有显著性（P＜0.05），q值均＞1。表明DDP联合用VP和PSC833均有协同作用，即VP、PSC833有增敏作用。

　　二、细胞周期变化

　　1.S期细胞变化：S期细胞比例在各组中变化最为明显，见表1。在DDP浓度为0.13～1.00μg/ml时，各实验组S期比例随DDP浓度增大而增高；当DDP浓度为2.00μg/ml时，各实验组S期比例与对照组比较均大幅下降（P＜0.01）。

表1　各组药物作用于COC₁、COC₁/DDP后的细胞周期构成比(％)

　　^*与对照组比较，P均＜0.01

　　2.G₀～G₁期细胞变化：在DDP浓度为2.00μg/ml时，G₀～G₁期细胞比例明显升高（P＜0.01）。

　　3.G₂～M期细胞变化：G₂～M期细胞在S期减少的同时升高不明显（P＞0.05）。

　　三、细胞凋亡

　　1.凋亡细胞的形态学观察:光学显微镜下，对照组细胞大小一致，核染色淡而均匀；实验组细胞体积缩小、边缘光滑、核浓染、核碎裂、细胞浆空泡化伴有出泡现象、凋亡小体形成。见图1，2。电子显微镜下，核边聚，呈块状分布，内质网、线粒体完整，微绒毛稀少。

图1　DDP（1.0μg/ml）作用下的COC₁凋亡细胞．

　　箭头所示为核碎裂，凋亡小体形成．HE×400

图2　DDP(2.0μg/ml)联合PSC833（0.3μg/ml）作用下的COC₁／DDP凋亡细胞．

　　箭头所示为核碎裂、边聚，凋亡小体形成．HE×400

　　2.Comet分析：荧光显微镜下，非凋亡细胞电泳时核原地不动，凋亡细胞电泳时，可见大量DNA片段向正极移动。见图3，4。

图3　凋亡细胞Comet图像．箭头所示为大量DNA片段向正极移动．EB×400

图4　非凋亡细胞Comet图像，细胞核在原位置．EB×400

　　3.流式细胞仪观察：凋亡细胞主要聚中在凋亡区域，随着DDP浓度增高，凋亡区域细胞逐步增多。但未观察到明显亚G₁期细胞峰出现。

　　4．细胞凋亡率：采用光学显微镜与荧光显微镜计数各组细胞凋亡率。见表2。COC₁细胞中，当DDP浓度为1.00μg/ml时，细胞凋亡率最高为8.35％；COC₁/DDP细胞中，DDP（0.50～2.00μg/ml）联用PSC833时，细胞凋亡率随DDP浓度增加而明显升高，与对照组比较，差异均有显著性（P＜0.05）。

表2　COC₁、COC₁/DDP在各组药物作用下的细胞凋亡率(μg/ml，％)

　　^*与对照组相比，P＜0.05讨论

　　一、VP、PSC833与DDP的关系

　　VP、PSC833能提高白血病、卵巢癌、宫颈癌等对丝裂霉素、长春新碱、长春花碱、DDP的敏感性^［5,6］。本研究结果表明，VP（0.38～3.00μg/ml）、PSC833（0.15～1.20μg/ml）对卵巢癌细胞抑制率小，均不超过4.00％；而VP(3.00μg/ml)、PSC833(0.30μg/ml)时均能明显增强COC₁、COC₁/DDP对DDP的敏感性；光学显微镜、电子显微镜及流式细胞仪检测结果也表明，DDP联用VP或PSC833更具杀伤力。

　　二、DDP对细胞周期的影响

　　目前，多数学者认为，DDP对卵巢癌细胞S期影响最大，导致S期细胞比例增高，S期通过时间延长。Vaisman等^［7］认为，细胞周期的变化在DDP浓度较低时是可逆的，变化的细胞周期可快速恢复正常；而在DDP浓度为50％抑制浓度(IC50)时出现S期通过延长，DDP浓度为IC90时，细胞多处在S期。本研究结果支持上述观点，各实验组细胞出现了不同程度的S期细胞增多现象，其中COC₁细胞在DDP浓度为1.00μg/ml时S期比例达99.67％；而在较高浓度的DDP（2.00μg/ml）作用下，S期细胞急剧减少至33.61％，说明S期细胞大量死亡。如果不是S期细胞死亡而是进入了G₂～M期，那么G₂～M期细胞比例会大幅上升，但本研究结果不支持此假设。

　　三、DDP与细胞凋亡及细胞凋亡与DDP耐药的关系

　　大量体内外实验证实，诱导卵巢癌细胞凋亡是顺铂重要的作用机理。Ormerod等^［8］认为，低浓度DDP作用时细胞死亡以坏死为主，在DDP浓度为3×IC50时，死亡细胞中，细胞凋亡的发生率为60%～70％，而在≥10×IC50时，死亡细胞几乎全是凋亡细胞。凋亡的判断主要根据细胞形态学观察^［2］，Comet分析对单细胞凋亡十分敏感，其敏感度有报道高于流式细胞仪。本研究中，光学显微镜、电子显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪均证实了细胞凋亡的发生，其中DDP（2.00μg/ml）联用PSC833（0.30μg/ml）作用于COC₁/DDP时，细胞凋亡率达33.80％，而此时细胞抑制率为37.81％，表明此时细胞死亡主要是细胞凋亡。流式细胞仪观察没有出现亚G₁期细胞峰，表明细胞凋亡并非发生于G₁期细胞，而主要是在S期细胞中，这与有关文献报道一致^［7-9］。

　　Eliopoulos等^［10］证实，对顺铂耐药的细胞凋亡减少。本研究结果显示，COC₁、COC₁/DDP对DDP敏感性不同，同时对细胞凋亡的敏感性也不同。在COC₁细胞中，DDP联用VP或PSC833时细胞生长抑制率升高，而细胞凋亡率变化不明显，可能是COC₁细胞中大量凋亡，敏感细胞在药物诱导下很快发生细胞凋亡,细胞凋亡已经饱和,因而未观察到凋亡高峰。DDP联合PSC833组中，COC₁/DDP细胞的凋亡率较其他组明显增高，最高为33.80％，表明COC₁/DDP可能存在着细胞凋亡被抑制的情况，PSC833可以恢复其凋亡潜能，增强DDP诱导的细胞凋亡；DDP联合PSC833组中，COC₁细胞的凋亡率增高不明显，表明PSC833不能增强已经饱和的细胞凋亡。增强DDP诱导细胞凋亡可能是PSC833增敏机理之一，与Shi等^［11］研究DDP增敏剂霉帕霉素(Rapamycin，一种免疫抑制剂)的结果相似。VP增敏可能是通过另一途径实现,有待进一步证实。

　　参考文献：

　　［1］周友珍,陈惠祯,杨庆忆，等.人卵巢癌顺铂耐药细胞株的建立及其耐药机制的研究.中华医学杂志,1996,76:680-683.

　　［2］Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implication in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972,26:239-257.

　　［3］Jin ZJ. Addition in drug combination. Acta Pharmacol Sin, 1980,1:70-76.

　　［4］Olive PL, Banath JP , Durand RE. Heterageneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the “Comet” assay. Rediat Res, 1990,122:86-94.

　　［5］Tsuruo T, Lida H, Tsukagesh S, et al. Overcoming of vincristine resistance in p388 leukemia in vivo and in vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblastine by verapamil. Cancer Res, 1981,41:1967-1972.

　　［6］Roland PK, Altermatt HJ, Doratsch P, et al. Pharmacological interactions between the resistanc-moditying cyclosporine SDZ PSC833 and etoposide (VP16-213) enhance in vivo cytostatic activity and toxicity. Int J Cancer, 1992,51:433-438.

　　［7］Vaisman A, Varchenko M, Said L, et al. Cell cycle changes associated with formation of Pt-DNA adducts in human ovarian carcinoma cells with different cisplatin sensitivity.Cytometry, 1997,27:54-64.

　　［8］Ormerod MG, O′neill C, Robertson D, et al. Cis-diamminedich-loroplatinum (Ⅱ)-induced cell death through apoptosis in sensitive and resistant human ovarian carcinoma cell lines. Cancer Chemother Pharmacol, 1996,37:463-471.

　　［9］Ormerod MG, O′neill C, Robertson D, et al. Cisplatin induce apoptosis in a human ovarian carcinoma cell line without concomitant internucleosomal degradation of DNA. Exp Cell Res, 1994,21:231-237.

　　［10］Eliopoulos AG, Kerr DJ, Herod J, et al. The control of apoptosis and drug resistance in ovarian cancer:influence of p53 amd bcl-2. Oncogene, 1995,11:1217-1228.

　　［11］Shi Yu, Frankel A, Laszlo G,et al.Rapamycin induces apoptosis and increases sensitity to cisplatin in vitro. Cancer Res, 1995,3:1982-1988.

收稿日期：1999-03-11