流式细胞术检测化疗前后卵巢癌细胞凋亡的临床意义

癌症 2000年第4期第19卷 基础研究

作者：尹格平　李强　陈诵芬　孙晓明　吴战英　朱彤宇

单位：李强（山东医科大学第二附属医院妇产科,山东　济南　250013）；尹格平　陈诵芬　孙晓明　吴战英　朱彤宇（济南军区总医院妇产科，山东　济南　250031）

关键词：卵巢肿瘤；细胞凋亡；化学疗法；凋亡因子

　　【摘要】目的：探讨化疗前后卵巢癌细胞及外周血淋巴细胞凋亡率及凋亡因子Fas和Apo2.7的含量及其临床意义。方法：从75例化疗前后卵巢癌患者的腹水中提取富含癌细胞的悬液，用AnnexinV－FITC/PI双染法分辨凋亡细胞及坏死细胞，并以两种凋亡因子单克隆抗体Fas和Apo2.7标记上述细胞，均用流式细胞仪检测。结果：化疗后卵巢癌细胞凋亡率显著高于化疗前的临床疗效好,反之疗效差；被Fas及Apo2.7标记的癌细胞率显著增加者临床疗效好，反之疗效差；化疗后外周血淋巴细胞凋亡率及凋亡因子有不同程度的增加。结论：通过对化疗前后卵巢癌细胞凋亡程度的检测，有助于判断化疗效果，有重要的临床意义。

　　中图分类号:R737.31　文献标识码：A　文章编号：1000－467X（2000）04－0383－04

The FCM study of tumour cellular apoptosis in patients with ovarian carcinoma before and after chemotherapy

YIN Ge-ping　CHEN Song-fen　et al.

　　（The Jinan Military General Hospital, Jinan 250031,P.R.China.）

　　LI Qiang

　　（The Second Affiliated Hospital of Shandong Medical University, Jinan 250013,P.R.China.）

　　【Abstract】 Objective: To Study the apoptotic rates (AR) and the contents of CD95 (Fas factor) and Apo2.7 by FCM in ovarian cancer cells(OCC) and its peripheral blood lymphocytes (PBL) as well as the clinical significance. Methords: Ovarian carcinoma cell(OCC) suspensions were collected from ascites samples in 75 patients with advanced ovarian carcinomas before and after chemotherapy respectively.The samples of OCC were painted by Annexin V-FITC/Propidium iodide(PI) and assayed its AR, which could distinguished early apoptotic cells from necrotic cells. The ATC suspensions were also labelled by monoclonal antibodies of CD95 and Apo2.7. Results: The curative effect in which patients whose AR, as well as the contents CD95 and Apo2.7 of OCC become statistically more increased after chemotherapy than before was satisfied;the AR as well as the contents of CD95 and Apo2.7 of PBL also become increased in different degree. Conclusions: The assay of OCC apoptotic degree before and after chemotherapy is help to indicate the curative effect for ovarian carcinoma,and has important clinical significance.

　　Key words: Ovarian tumor; Apoptosis; Chemotherapy; Monoclonal antibody; CD95; Apo2.7

　　近年来以顺铂(Pt)为主的联合化疗已使卵巢癌患者的生存时间明显延长，但随着化疗时间的延长，卵巢癌细胞(Ovarian carcinoma cell.OCC)对多种化疗药物产生耐药性^[1,2]。目前少见监测化疗疗效的客观指标。本文通过对化疗前后OCC及外周血淋巴细胞(Peripheral blood lymphocyte.PBL)凋亡率及两种凋亡因子Fas(CD₉₅)和A_po2.7的流式细胞定量测定，探讨其临床意义。

　　1　材料及方法

　　1.1病例及标本来源

　　75例初发卵巢癌为我院1995年12月至1998年12月住院患者。该组患者入院时均出现腹水(腹凋亡水癌细胞涂片均阳性)。单独腹腔顺铂化疗者57例(Pt:100mg/m²单独腹腔灌注，每疗程1次)，合并静脉化疗者18例（环磷酰胺静脉滴注5mg/kg，每日1次共5天和/或阿霉素35mg/m²，每疗程静滴1次）。本组术后复发并出现腹水者17例。所有患者手术前先行腹腔穿刺抽取腹水50ml（抗凝），并行Pt腹腔灌注，同时抽外周静脉血2ml（抗凝）,3～5天后在行细胞减灭术时又抽腹水及外周静脉血标本。每例患者均于化疗前及化疗后第四周时B超测量腹水指数（脐周四个象限腹水液面的深度之和再除以4)。

　　1.2特殊试剂

　　异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人单克隆抗体分子探针CD₉₅、R－藻红蛋白(PE)标记的单克隆抗体分子探针A_po2.7、用于排除免疫标记误差的羊抗鼠IgG1(作为非特异免疫标记对照)和FITC标记的AnnexinV(磷脂结合蛋白V)均由深圳晶美免疫公司提供。

　　1.3外周血淋巴细胞(PBL)的分离

　　将2ml静脉血(抗凝)放入10ml容量试管，加入2ml淋巴细胞分离液，离心（1500r/min、10min），提取其中淋巴细胞层，再以磷酸缓冲液(PBS)2ml漂洗，同速离心2次，弃上清液后，将细胞悬液分装4支5ml容量试管，调整细胞数为10⁵/ml，备用^[2]。

　　1.4腹水中卵巢癌细胞的悬液(OCC)的分离

　　抽腹水50ml（抗凝），离心（1500r/min、10min），弃去上清后加入淋巴细胞分离液2ml，同速离心，收取分离液表面细胞，以2mlPBS漂洗离心1次，弃上清后将细胞加于100％:65％的双层淋巴细胞分离液表面,离心吸收65％分离液上界面的细胞即为OCC悬液。将细胞悬液分入4支5ml容量试管，调整细胞数为10⁶/ml，备用^[2]。

　　1.5单克隆抗体CD₉₅－FITC及A_p2.7－PE直接免疫标记

　　取3支试管,各加OCC悬液500μl,分别加入CD₉₅、A_po2.7及IgG1工作液20μl（工作浓度为10～20μg/ml)，避光室温下20min。离心（1500r/min、10min)。除上清液后加PBS0.5ml，避光4℃存放，待检。

　　1.6细胞标本的AnnexinV－FITC/PI(碘化丙啶）双染色

　　第4支试管中加490μlOCC悬液再加入AnnexinV－FITC5μl（工作浓度为10μg/ml)和PI5μl（工作浓度为250μg/ml)。室温避光10min。

　　1.7流式细胞仪检测

　　用FACScan型流式细胞仪分别检测凋亡率及凋亡因子。每支试管上机收集2万个细胞。CD₉₅及A_po2.7含量计算公式：

　　1.8统计方法

　　计量资料用t检验，可信限取P＜0.05和P＜0.01。

　　2　结果

　　2.1化疗前后PBL凋亡率及凋亡因子的改变（表1）

表1　化疗前后PBL凋亡率及凋亡因子含量变化(±s)

注：＊P＜0.05，＊P＜0.01（均与同组化疗前比较）

　　合并静脉化疗后PBL凋亡率较化疗前增加4.18倍，有显著性差异(P＜0.05)；CD₉₅及A_po2.7分别增加6.20及9.73倍，有显著性差异(P＜0.01)。单独腹腔灌注化疗后PBL凋亡率及凋亡因子CD₉₅、A_po2.7较化疗前增加，但无显著性差异（P＞0.05）。

　　2.2腹腔化疗前后腹水OCC之凋亡因子含量变化(表2及图1)

图1腹腔化疗前后腹水OCC凋亡因子

　　CD₉₅.A_po2.7流式组方图

　　A－化疗前CD₉₅，B－化疗后CD₉₅；C－化疗前A_po2.7，

　　D－化疗后A_po2.7左峰：阴性细胞；右峰（M1)：阳性细胞。

表2　化疗前后OCC凋亡率及凋亡因子含量变化(±s)

注：△P＜0.01（均与同组化疗前比较）

　　两组化疗后OCC凋亡率及CD₉₅、A_po2.7含量明显增高,有非常显著性差异(P＜0.01)。

　　2.3AnnexinV－FITC/PI双染法辨别坏死及凋亡细胞(见图2)

图2腹腔化疗前后OCC凋亡及坏死情况

　　(AnnexinV－FITC/PI双染法)

　　左图－化疗前；右图－化疗后。右上象限AnnexinV－FITC⁺/PI⁺细胞为坏死细胞；右下象限AnnexinV－FITC⁺/PI^－细胞为凋亡细胞；左下象限Annexin－FITC^－/PI^－细胞为活细胞。

　　腹腔化疗后OCC之凋亡细胞数较前明显增加（P＜0.05）；而坏死细胞数较前无明显增加（P＞0.05）。此结果说明化疗能增加OCC的凋亡。

　　2.4复发组腹腔化疗前后OCC凋亡率及凋亡因子含量（见表3）

表3　复发组腹腔化疗前后OCC之凋亡率及CD₉₅、A_po2.7变化(＋s)

注：△P＜0.05（均与同组化疗前比较）

　　复发组腹腔化疗后凋亡率及CD₉₅、A_po2.7较化疗前均明显增加，差异有显著性(P＜0.05)；与初发单腹腔化疗组比较，化疗前三项指标均值都低于初发组，但无显著性差异(P＞0.05)，化疗后三项指标均显著性低于初发化疗后组(P＜0.05)。此结果一方面提示复发组腹腔化疗后，其疗效不及初发组；另一方面提示那些腹腔化疗后OCC凋亡少者疗效较差，容易复发。

　　2．5化疗后癌细胞凋亡与腹水指数的关系

　　75例患者中经化疗后第四周感腹水症状明显减轻者47例，无明显改善者25例，该两组化疗后癌细胞凋亡率与腹水指数的关系见表4。

表4　化疗后癌细胞凋亡率与腹水指数的关系(±s)

注：＊P＜0.05（两组比较）。

　　t检验证实腹水明显减轻组四周后腹水指数显著性低于腹水无改善组(P＜0.05），腹水明显减轻组化疗期间凋亡率（PI）显著性高于腹水无改善组(P＜0.05）。提示化疗后癌凋亡率的提高与腹水体征改善有明显的一致性。

　　3　讨论

　　细胞凋亡(Apoptosis)是细胞程序性死亡^[3]。细胞凋亡早期改变之一是细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转向到细胞膜外。AnnexinV是一种分子量为35～36Kd的钙依赖磷脂结合蛋白，具有易于与磷脂类如PS结合的特性,对转向到细胞膜外的PS有高度的亲和性^[4]。由于PS外转到细胞膜外是细胞凋亡过程中的早期改变，所以用FITC标记AnnexinV染色能够较检测细胞核改变如DNA碎片更早地辩别凋亡细胞。但是由于在坏死细胞膜上也存有外转的PS，也可被AnnexinV染色。单独应用AnnexinV染色仍然不能将凋亡与坏死细胞分辨开来。所以用FITC标记AnnexinV,结合使用PI对凋亡细胞进行双染色,即可区别凋亡细胞(AnnexinV－FITC/PI^-)与坏死细胞(AnnexinV－FITC/PI^＋)^[5]。凋亡或细胞程序性死亡可因Fas抗原的作用启动。细胞表面分子Fas（又称CD95或Apo－1）是分子量48KD的膜糖蛋白,属肿瘤坏死因子(TNF)家族^[6]。A_po2.7抗原是38KD的细胞线粒体膜蛋白,当凋亡发生时出现。有研究指出A_po2.7与凋亡过程的分子链反应有关,它在凋亡的早期出现而不是细胞坏死的终末产物^[7]。近期研究证实多种细胞毒性抗癌药物可以诱导细胞凋亡，如顺铂及阿霉素(ADM)^[8]等。目前的研究认为在例行的化疗过程中癌细胞多药耐药基因(mdr-1)表达逐渐产生了多药抗药性，使化疗效果逐渐下降^[2],故研究化疗过程中监测和加强癌细胞凋亡程度,是肿瘤治疗中十分有价值的课题^[9]。

　　从本研究结果看，不同的患者经相同化疗药物作用后其癌细胞凋亡率和凋亡因子CD₉₅、A_po2.7含量增加的程度不同，反映了个体对化疗不同的敏感性。复发组经腹腔化疗后其OCC凋亡程度虽较化疗前显著性增加，但不及初发组经化疗后癌细胞凋亡的程度，有显著性差异(P＜0.05)。这也从另一个侧面反映了那些经化疗作用后癌细胞凋亡率和CD₉₅、A_po2.7无明显增加者更易复发。本文选择的细胞凋亡率、CD₉₅及A_po2.7三项指标用以反映卵巢癌细胞对化疗敏感性的临床指标，有重要的临床价值。有关这三项指标能够反映最佳化疗效果的客观标准，尚待进一步临床研究。

　　通讯作者：尹格平　Tel：86－10－67781331－8437

　　[参考文献]

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收稿日期：1999－10－05

　　修回日期：1999－11－05