常规化疗药物诱导卵巢癌OVCAR-3细胞凋亡特点的分析

中国肿瘤临床 2000年第3期第27卷 论　著

作者：罗阳　刘佳　郭丽　江岩　李宏

单位：罗阳(沈阳医学院分子生物学研究室　沈阳市　110031)；刘佳(沈阳医学院分子生物学研究室　沈阳市　110031)；郭丽(沈阳医学院分子生物学研究室　沈阳市　110031)；江岩(沈阳医学院分子生物学研究室　沈阳市　110031)；李宏(沈阳医学院分子生物学研究室　沈阳市　110031)

关键词：卵巢癌；化疗；凋亡

　　摘要　目的：观察抗卵巢癌药物顺铂、紫杉醇和阿霉素对卵巢癌细胞系OVCAR-3体外生长和生存的影响并分析由它们所致的细胞死亡性质。方法：采用细胞形态学观察、细胞动力学检测及DNA片段化分析等细胞和分子生物学方法，研究化疗药物对卵巢癌细胞的凋亡诱导作用。结果：上述药物在抑制OVCAR-3细胞生长的同时可不同程度地诱导细胞凋亡。其中，紫杉醇诱导细胞凋亡的能力最强；较低剂量紫杉醇(10^－8M)和顺铂(2μg/ml)配伍使用的抗癌效果优于单纯顺铂(5μg/ml)或顺铂(2μg/ml)+阿霉素(0.5μg/ml)。结论：1)化疗药的抑癌作用主要是通过诱导卵巢癌细胞凋亡来实现；2)抗癌药诱导细胞凋亡的能力与其生长抑制效应成正比；3)对靶细胞凋亡的诱导能力可作为筛选抗卵巢癌敏感化疗药物以及最佳配伍剂量的客观指标。

　　Apoptosis of Human Ovarian Cancer Cells Induced

　　by Chemotherapy

Luo Yang　Liu Jia　Guo Li

　　（Division of Molecular Biology, Shengyang Medical College,Shengyang）

　　Abstract　Objective：To observe the effect of cisplatin, taxol and adriamycin on in vitro growth as well as the nature of cell death of human ovarian cancer cell line OVCAR－3.Methods：The hallmarks of apoptosis of OVCAR－3 cells treated by chemotherapeutic agents were studied by multiple approaches of cytology and molecular biology.Results：It is revealed that these drugs can inhibit cellgrowth by inducing apoptotic cell death. Taxol showed the best anti cancer effect in a dose-related fashion. A combination of lower dosages of taxol (10^-8M) and cisplatin (2ug/ml) can achieve better inhibitory effect than cisplatin(5ug/ml) only or cisplatin (2ug/ml)+adriamycin (0.5ug/ml).Conclusion：Our data suggest that 1) the death of ovarian cancer cells caused by the three anti ovariancancer drugs is by way of apoptosis.2)the efficiency of apoptotic induction of chemotherapic drugs is closely correlated to their effect on growth. 3)the ability of apoptotic induction would be a reliable parameter in determining effective agents for chemotherapy.

　　Key Words　Ovarian cancer　Chemotherapy　Apoptosis

　　卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，它多在晚期才被发现，故复发率和死亡率颇高。因此，在手术为主的同时，需辅以术后化疗。目前采用的卵巢癌化疗方案种类繁多，其疗效的评价主要依靠体外细胞动力学改变，体内肿瘤大小变化，患者的中、远期存活率以及肿瘤复发率的统计^［1］。可见，较为准确地评估各种药物的疗效仍很困难。

　　已知，癌症是一种细胞内在死亡程序紊乱性的疾病^［2］，这需要促进细胞持续生长的新蛋白质的合成。由于化疗药物能够干扰肿瘤细胞生存所必须的核酸和(或)蛋白的合成^［3］，有理由推测，在化疗药的作用机制和细胞凋亡的诱因间，可能存在一定的内在联系。本研究选用临床常用抗癌药，顺铂和阿霉素，以及抗卵巢癌新药紫杉醇，体外观察它们对靶细胞的凋亡诱导能力，以期为可靠选择抗卵巢癌药物，及其合理的配伍提供科学依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂及药物

　　紫杉醇由中国医学科学院药物所植化室提供；顺铂和阿霉素分别由齐鲁制药厂和意大利爱宝制药厂生产。凋亡检测试剂盒(Insitu cell death detection kit,AP)购自德国BM公司。紫杉醇溶于二甲基亚砜中，配成0.01mol/L的储存液备用；顺铂和阿霉素用生理盐水分别配成2mg/ml和1mg/ml的储存液备用。上述药物使用时用培养液稀释成所需的浓度。

　　1.2　细胞培养和处理

　　人卵巢癌细胞系OVCAR-3来源于卵巢低分化乳头状腺癌患者的恶性腹水^［4］，细胞在含5%胎牛血清的RPMI-1640培养液，37℃，5%CO₂和95%湿度的条件下培养。细胞铺皿前24小时，将1.0×1.0(cm)的灭菌盖玻片放入六孔培养皿(Costar,USA)，每孔放4张玻片，每3孔为一个处理组，将浓度为6.0×10⁴的OVCAR-细胞、均匀铺于皿中，常规孵育24小时，换液后分别加入最终浓度为5μg/ml顺铂、10^－6M紫杉醇、2μg/ml顺铂+10^－8M的紫杉醇和2μg/ml顺铂+0.5μg/ml阿霉素，未经处理的细胞作为正常对照，同时用使用浓度的DMSO处理细胞，做背景对照。

　　1.3　形态学观察及凋亡细胞检测

　　分别于培养24、48、72小时，取出长有细胞的玻片，每组取4片，PBS洗3次，做如下检测：1)其中一张片用冷丙酮固定3分钟，常规HE染色，光镜下观察细胞形态学改变；2)两张片用4%多聚甲醛溶液固定30分钟，使用末端脱氧核苷酸转移酶介导生物素标记(TUNEL)试剂盒对各组细胞DNA片段化情况加以分析，实验步骤按说明书进行。另一张省略TUNEL标记步骤的玻片做阴性(背景)对照；正常培养细胞做非处理对照，光镜下观察凋亡细胞特征性改变。分别计数各处理组及对照组每100个细胞中凋亡细胞所占的比率^［5］。

　　1.4　细胞动力学检测

　　常规培养的OVCAR-3细胞，以6.0×10⁴的密度接种于24孔培养板(Costar,USA)，药物处理后第24、48和72小时，经台盼蓝区分法分别计数药物处理组和对照组细胞总数和死活细胞比值，每次计数8个视野，结果以均值表示。描绘不同处理条件下细胞生长曲线。

　　1.5　DNA提取和分析

　　根据细胞学检测结果，选择有最佳生长抑制效应的药物浓度处理细胞。48小时后，将药物处理组及对照组的细胞用PBS洗3次，离心收集后，按常规方法提取基因组DNA^［5］，取5μg样本DNA，在含溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶(Promeaga,USA)中电泳，紫外透射下拍照，做DNA片断化分析。将在无IL-6的培养液中孵育的小鼠B-杂交瘤7TD1细胞DNA做凋亡阳性对照^［6］，将正常培养细胞的DNA做非处理对照。

　　2　结果

　　2.1　化疗药作用下OVCAR-3细胞形态学改变

　　对顺铂和紫杉醇处理48小时的OVCAR-3细胞群体的形态学观察发现，细胞有不同程度的围绕核膜的染色质浓缩，胞质空泡样改变和细胞皱缩。严重者核膜消失，胞膜出现“疱样结构”，形成若干个含核物质的圆形细胞碎片(小体)。凋亡核的TUNEL染色显示：各处理组均可见到凋亡阳性标记的细胞，胞体较小，核深染，核周有被标记的特征性黑色光环(图1)。凋亡阳性标记的细胞比率以紫杉醇处理组为最高，其次是紫杉醇与顺铂配伍组。

图1　药物处理前后OVCAR-3细胞的TUNEL标记染色　(×40)

　　正常培养细胞对照(上图)；紫杉醇处理48小时(下图)

　　2.2　各组化疗药对OVCAR-3细胞生长抑制效应比较

　　各处理组与未处理组比较，5μg/ml顺铂、10^-6M紫杉醇、2μg/ml顺铂+10^-8M的紫杉醇和2μg/ml顺铂+0.5μg/ml阿霉素，均可使OVCAR-3细胞受到明显的生长抑制，细胞生长缓慢，生长曲线变低平。并发现含有紫杉醇的处理组细胞生长抑制效果最佳。DMSO背景对照组与正常培养对照组细胞生长情况未见差异。各处理条件下细胞生长状况见图2，3。

图2　不同处理条件下，OVCAR-3细胞的生长曲线

图3　培养48小时，OVCAR-3细胞的生长和存活情况

　　(数值为凋亡细胞百分率)

　　2.3　DNA电泳分析

　　DNA电泳分析显示：未处理组细胞显示较完整的基因组DNA大片段，而药物处理48小时后的各组细胞DNA电泳均呈现不同程度的DNA片段化或降解的趋势(图4)，且与癌细胞生长抑制和凋亡形态学变化程度相一致。

N：正常培养对照；(+)：无IL-6生长条件下的7TD1细胞阳性对照；1.顺铂 2.紫杉醇 3.顺铂+紫杉醇 4.顺铂+阿霉素

4　用1.5%琼脂糖电泳对不同处理条件下OVCAR-3细胞DNA片断化分析

　　3　讨论

　　目前临床多采用以顺铂为基础的卵巢癌单纯化疗方案，或顺铂与环磷酰胺、阿霉素等配伍的联合方案，但疗效不甚理想。其原因，除卵巢癌自身特点外，主要是化疗药的明显毒副反应和癌细胞的耐药易感性等问题^［7］。因此，寻求较为可靠的客观指标评估，筛选抗癌药物的疗效是卵巢癌治疗中的重要课题之一。

　　本研究选用新型抗癌药紫杉醇和临床常规化疗药顺铂和阿霉素，体外处理卵巢癌细胞。各种检测的结果表明，上述药物及其配伍均可诱导卵巢癌细胞凋亡；其中，以紫杉醇的作用最显著。其次是紫杉醇+顺铂配伍组，二者在处理48小时和72小时分别相差7%和2.7%，虽然紫杉醇+顺铂配伍组诱导细胞凋亡的百分率低于单纯紫杉醇组，但由于使用剂量降低，故具有一定的临床意义。在上述药物诱导卵巢癌凋亡的过程中，出现了一系列颇为典型的细胞凋亡的改变，且与癌细胞生长抑制成正相关。与以往报道相似，本研究亦发现药物诱导的DNA降解多为较大的不典型片段。虽然它无典型梯状结构出现，但可被凋亡抑制基因bcl-2的表达抑制，这表明上述DNA降解是化疗药等所致细胞凋亡的特征之一^［8］。而本研究则在卵巢癌体外实验体系再次证明，化疗药对卵巢癌细胞的杀伤机制主要是通过诱导细胞凋亡来实现。

　　与凋亡诱导能力相一致，抑癌分析的结果亦显示：紫杉醇对OVCAR-3细胞的生长抑制作用最强，低浓度顺铂和紫杉醇的配伍处理次之。作为临床抗卵巢癌的首选药物，紫杉醇对防治术后复发或顺铂耐药性肿瘤均有很好的疗效^［9］，但其明显的副作用却影响了它的持续使用。本研究发现，将紫杉醇和顺铂的常规使用药量分别降低100倍和10倍后，配伍使用，虽然较单纯紫杉醇的效果低2.7%(处理72小时)，但其生长抑制和凋亡的诱导能力仍优于单纯顺铂或目前临床常用的顺铂+阿霉素配伍。资料显示，因药理作用有所不同，故顺铂和紫杉醇无叠加的毒副作用，两者既能在Ⅰ期临床试验安全合用，也可联合治疗难以切除的Ⅲ期与Ⅳ期卵巢癌^［10］。而本文结果进一步提示，在保证疗效的情况下，低剂量配伍使用这两种药物的可能性。若能在实验动物体内验证本文结果，则更具临床意义。

　　总之，本研究表明，对凋亡的诱导能力是筛选抗卵巢癌敏感药物的理想指标，降低同等疗效下化疗药对机体的毒副作用，对提高卵巢癌临床化疗效果具有重要的意义。

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收稿日期：1999-04-08