ATP生物发光法检测卵巢癌细胞化疗敏感性的可行性研究

江苏医药 1999年第5期第25卷 论著、经验交流

作者：韩国荣　张　林　苏佩敏　沈　玲

单位：南京市第二医院　邮政编码：210003

关键词：卵巢肿瘤　药物敏感性　ATP生物发光

　　摘要　目的：探讨三磷酸腺苷(ATP)检测法作为卵巢癌体外药敏试验的可行性。方法：采用ATP法，检测6种化疗药物对卵巢癌3AO细胞株的抑制作用，并与活细胞数作为对照。结果：(1)ATP水平与活细胞数相关性极好(γ=0.9884)，灵敏度高，最低可检测出80个细胞。(2)ATP法结果稳定、简便快捷，可定量。(3)药物浓度不宜过大，应选择在0.5～2.0PPC之间。(4)检测时间以用药后4～5天为宜。结论：ATP法可做为一种新的卵巢癌化疗药物体外敏感试验方法。

　　近年来人们一直在探索一种简便而又能准确预测个体对化疗药物敏感性的体外药敏方法，使化疗具有预见性。迄今，常用的体外药敏方法都存在着一定问题，未能在临床上推广应用。本研究通过检测卵巢癌细胞内的三磷酸腺苷(ATP)含量，观察化疗药物的细胞毒作用，探讨ATP法作为卵巢癌的一种新的体外药敏试验方法的可行性。

　　材料和方法

　　一、试剂、药品与仪器

　　试剂：RPMI1640培养基(美国，sigma)，小牛血清(天津生化制品厂)，荧光素-荧光素酶及ATP标准品(中科院植物所)，青霉素、链霉素。卵巢癌3AO细胞株(上海细胞生物所)。

　　化学药品：顺铂、平阳霉素、长春新碱、足叶乙甙、阿霉素、氟脲嘧啶。

　　仪器：FG―300型发光仪(中科院上海植物生理研究所研制)、二氧化碳培养箱、超净工作台、超低温冰箱、生物显微镜、96孔无菌培养板。

　　二、实验方法

　　1.ATP标准曲线的绘制

　　按3mg/ml称取荧光素-荧光素酶、溶于20mmol/L荧光素稀释液中。取10^-8～10^－12mol/L的ATP标准液0.2ml，置于发光分析仪内测定其发光强度，每种浓度作2个平行管，以ATP浓度对数为横坐标，发光强度对数为纵坐标，绘制标准曲线。

　　2.卵巢癌3AO细胞株的测试

　　取生长旺盛的3AO细胞，2%的台盼兰染色计活细胞数，等比稀释为6个浓度，加等量的4%三氯醋酸(TCA)提取ATP，取0.1ml混合液，加反应杯中测定，分析活细胞数与荧光计数值之间的关系。

　　3.ATP法检测

　　取生长旺盛的3AO细胞胰酶消化后收集细胞悬液，稀释浓度至3×10⁴/ml，96孔板每孔加入细胞悬液0.1ml，实验组加待测药物至终浓度(药物浓度参照血浆峰浓度PPC)，对照组加等量培养液，使最终体积为0.2ml。分别检测6种药物不同浓度的细胞抑制率，每个培养条件重复3孔，每块板设不加药肿瘤细胞对照组和无细胞空白对照各6孔。在37°C、5%CO₂的湿性培养箱中培养4天后，用Hank's液洗涤2次，每孔加0.1mlHank's液，再加等量4%TCA迅速混匀，以3000r/min低温离心5分钟，吸取上清液0.1ml加等量Tris缓冲液混匀，置FG―300发光仪中分析，以同步进样装置加入3mg/ml荧光素―荧光素酶0.5ml,记录发光脉冲，然后根据ATP标准曲线计算ATP含量，求出抑制率。

　　抑制率=(1-实验组ATP含量/对照组ATP含量)×100%。抑制率大于50%为敏感，小于50%为耐药。

　　4.活细胞计数

　　经药物孵育细胞用台盼兰染色，计算活细胞拒染率^［1］，与ATP发光分析法作相关分析。

　　结果

　　一、ATP标准曲线

　　以ATP浓度对数为横坐标，测定计数值对数为纵坐标，绘制标准曲线，直线方程为Y=10.785+0.799x，r=0.9849，对r进行t检验P＜0.001。

　　二、3AO细胞实际成活率与ATP法测定成活率的关系

　　以每毫升3AO细胞数对数为横坐标，发光计数值对数为纵坐标，绘制曲线，两者相关性极好，r=0.9884，对r进行t检验P＜0.001。最低检测下限为1×10^-12mol/L，细胞数为80个。

　　三、量效反应曲线的测定

　　本文用5组浓度，6种抗癌药对卵巢癌3AO细胞株作量效曲线测定。得出细胞对不同药物的敏感性不尽相同，除VCR外随着药物浓度增加，其抑制率增加。顺铂、5FU最敏感，而VCR不论浓度高低抑制率均＜50%。各药抑制率在0.5～2．0PPC浓度同处于IC50的线性区域内，对药物浓度的变化较为敏感。

　　四、时―效反应与药物培养时间

　　取卵巢癌细胞株与1PPC的DDP作用后，分别于1、2、3、4、5、7天培养后，测定各样本ATP含量，随药物培养时间延长，药物对细胞的毒性效应增加。但在4～5天时细胞的增长和药物的抑制率趋于稳定。

　　五、本法与活细胞计数比较

　　30份样本经药物作用后，用本法和活细胞计数法做双份平行对照试验，两者相关性良好，相关系数r=0.8742。

　　讨论

　　一、ATP法的原理与优点

　　ATP是活细胞代谢的主要能量来源，细胞代谢过程中ATP水平处于相对稳定的动态平衡状态。细胞死亡后在ATP酶的作用下迅速降解。ATP水平与活细胞数呈正相关，故测定ATP水平能显示细胞代谢的活跃程度，间接提供细胞增殖活性^［2］。

　　尽管人们已建立了多种体外细胞药敏试验方法，但因其成功率低，受试验条件限制而较难推广应用，而且对毒性剂量作用后处于静止状态的活细胞很难检出其活性。本法与其它方法比较，其优点在于对细胞增殖无依赖关系，不受同位素影响，在鉴别药物对细胞的抑制程度方面具有灵敏度高、快捷、简便、客观、可定量等优点。

　　本文用ATP生物发光法对卵巢癌3AO细胞株进行药敏测试，并与活细胞计数比较，两者具有较好的相关性。灵敏度高，每孔细胞数为80个便能测出发光强度的改变，最低检测下限为10^－12mol/L。Pen等用本法与集落法对照比较，结果两法符合率77%^［3］。因此，ATP法作为一种体外化疗药敏试验方法具有明显的优势和前景。

　　二、药物对细胞的剂量―效应关系

　　药物对细胞的毒性作用与药物浓度有关，因此，区分某一浓度的药效作用十分重要，但不能以达到最大抑制率的药物浓度来做为判定指标，因为达到最大抑制时的药物浓度，可能已大大超过临床用药所能达到的血药水平，与实际药物应用相差甚远。

　　本实验结果表明不同药物对卵巢癌细胞株抑制的IC₅₀各不相同。5FU、ADM、DDP在0.5PPC浓度时抑制率＞50%，而VP-16和BLM分别在1.0PPC和2.0PPC时抑制率＞50%，VCR则无论浓度高低抑制率均＜50%。说明体外药物浓度是影响化疗药敏试验的重要因素之一，在一定范围内随浓度增加，药效增强，但对耐药的细胞不会因浓度的改变而改变。因此药敏试验的剂量选择在IC₅₀的线性范围内可增加试验敏感性的准确率。我们认为选用0.5～2倍血浆峰浓度比较合理。

　　三、药物对细胞的时间―效应关系

　　国外报道反应药物作用与对照差别的测定最佳时间为5～7天，本文时―效关系曲线中看出，随时间增加抑制率增加，但对照的ATP含量及用药组的抑制率在4～5天时比较稳定，根据文献报道肿瘤细胞需与药物作用48小时以上才能保证药物充分发挥作用^［4］，另外从临床实用角度，卵巢癌原代培养时间长，则成纤维细胞生长较多，故认为ATP法药敏试验测时间选在用药后4～5天。

　　参考文献

　　［1］　Kuzmits R,et al.Clin Sci 1986;71:86.

　　［2］　胡天喜主编.发光分析与医学.上海：华东师范大学出版社，1993；340.

　　［3］　Pen Z,et al.Cancer Res 1987;28(Suppl):427.

　　［4］　张婧，等.军事医学科学院院刊1997；21：4.

(1998年11月27日收稿　1999年1月19日修回)