卵巢肿瘤p16蛋白的表达及意义
中国肿瘤临床 2000年第4期第27卷 论著
作者：袁碧波 张士伟 孙保存 刘容珍
单位：张士伟 天津医科大学总医院妇科（天津市 300052）；袁碧波天津医科大学第二医院；刘容珍 天津医科大学第二医院；孙保存 天津医科大学附属肿瘤医院病理科
关键词：卵巢癌；细胞增殖；p16免疫组化
摘要 目的：研究p16在卵巢肿瘤中的表达及意义。方法：应用免疫组化ABC法检测133例卵巢肿瘤和12例正常卵巢组织p16的表达。结果：卵巢肿瘤与正常卵巢组织p16表达有显著性差异。正常卵巢没有p16表达的缺失，良性、交界性、恶性组p16表达明显下降(P＜0.05)。上皮性组晚期、残存癌灶≥2cm者p16表达明显低于早期、残存癌灶〈2cm者（P＜0.05）；p16表达与组织类型、组织分化、淋巴结转无关（P＜0.05）。生存分析表明p16尚不能作为卵巢癌的独 立预后因素。结论：p16蛋白在卵巢肿瘤中存在不同程度的缺失，与卵巢癌的发生、发展有 一定关系。p16能否作为卵巢癌的预后指标尚需进一步研究。
Expression of p16 in Ovarian Tumors and Its Clinical Significance
Yuan Bibo Zhang Shiwei Sun Baocun et al
(General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin)
Abstract Objective: To study the expression of p16 in ovarian tumors and its clinical significance. Methods: The expression of p16 was studied in 133 cases of ovarian tumor (OT) and 12 normal ovarian tissues (NOT) by immunohistochemical technique. Results: There was significant difference of p16 protein expression between OT and NOT （P＜0.05）.Loss of p16 protein was not detected in NOT,but detected in benign ovarian tumor,borderline ovarian tumor and maligmant ovarian tumor with a descending tendency （P＜0.05）.No difference of p16 protein expression was found between epithelial ovarian tumor (EOT)and non-epithelial tumor（P＜0.05）.In EOT group,the expression of p16 protein in specimens form advanced stage or large residual cancer was significantly lower than that of early stage of small residual cancer 2cm （P＜0.05）.No rslationship between the expression of p16 and histologic type,differentiation or lymph node metastasis of the tumor was found（P＜0.05）.Survival analysis revealed that p16 expression could not be a prognostic factor of ovarian tumor.Conclusion:Loss of p16 protein is observed in ovarian tumors and it is associated with tumorigenesis and development of the rumor.Therefore,lose of p16 protein may indicate the progression of ovarian canecr.
Key Words Ovarian tumor Cell proliferation p16 Immunohistochemistry
研究表明肿瘤的发生与细胞增殖失控，特别是G1期启动失控密切相关[1]。本文应用免 疫组化技术检测133例卵巢肿瘤和12例正常卵巢组织中对G1期启动具有重要调控作用的p16蛋 白的表达，探讨其在卵巢癌的发生、发展、预后中的作用。
1 材料与方法
1.1 临床资料
133例卵巢肿瘤来自我院1989年1月至1997年12月住院手术的卵巢肿瘤患者，并经病理证 实，分组如下：良性34例（粘液腺瘤20例，浆液腺瘤14例）；交界性10例（粘液腺瘤6例， 浆液腺瘤3例，卵泡膜细胞瘤1例）；恶性89例，其中：上皮性肿瘤73例（浆液腺癌51例，粘 液腺癌9例，低分化腺癌4例，内膜样癌2例，恶性勃勒那瘤2例，透明细胞癌5例；病理分级仅统计浆、粘液癌，内膜样癌和低分化腺癌，其中高分化17例，中分化26 例，低分化23例）；非上皮性肿瘤16例（无性细胞瘤3例，内胚窦瘤2例，颗粒细胞瘤9例， 中分化支持细胞瘤1例，小细胞癌1例）。Ⅰ期23例，Ⅱ期9例，Ⅲ期47例，IV期10例。淋巴 结转移情况：转移16例，无转移54例，无记载19例。术后残余病灶：残灶≥2cm31例，残灶＜2cm43例，无记载15例。除1例患者行病灶活检，其余患者均根据病情行相应手术。术后辅以 放、化疗。对恶性组全部89例进行随访，3例失访，最长随访96个月，最短1个月；死亡23例 ，其中1例死于肺癌,存活中位数25个月，3年累积生存率47.45％。收集同期因良性病变切除 的正常卵巢组织蜡块12例作为正常对照组。
1.2 方法
标本经10％甲醛固定，石蜡包埋，4μm切片。p16兔抗人多克隆抗体，SantaCrus公司产 品。ABC试剂盒为美国Vector公司产品。
1.2.1 实验步骤 常规ABC免疫组化法，进行抗原修复，p16工作浓度1:120。以PBS代替一抗 作空白对照。阳性对照：用已知有p16表达的卵巢浆液性腺瘤切片作为阳性对照。每次染色 均设阳性和阴性对照。
1.2.2 结果判定 p16阳性染色为胞核和（或）胞浆棕黄色颗粒沉着。阴性切片：阳性细胞 占5％以下且染色极浅。弱阳性（＋）：阳性细胞占6％～30％，染色呈淡黄色；阳性（＋＋ ）：阳性细胞在31％～60％之间，染色为棕黄色；强阳性（＋＋＋）：阳性细胞数在60％以 上，染色为棕褐色(见图1，2)。
图1 粘液性腺癌
Ⅰc期，中分化p16的表达主要为胞浆染色：浅p16×50
图2 浆液性腺瘤
p16为胞核着色，呈棕褐色p16×200
1.2.3 统计学方法 用χ2检验及Fisher′s精确检验。用Kaplan－Meier法计算生存率，用C ox比例风险模型进行生存回归分析。统计软件采用SPSS软件包及EPI6软件包。
2 结果
2.1 卵巢肿瘤和正常卵巢p16蛋白的表达
卵巢肿瘤与正常卵巢组织p16的表达有显著性差异(χ242.75，P〈0.01)。正常卵巢存不同程度的p16表达，在良性、交界性、恶性组p16阳性率下降，恶性组的阳性率明显低于交界性组(P=0.005)、良性组(χ2=21.43，P〈0.001)和正常卵巢组(P=0.000006)。恶性组的强 阳性率亦明显低于交界性(P=0.042)、良性(χ2=37.60，P〈0.01)和正常卵巢(χ2=34.52，P〈0.01)。交界性与良性比较，阳性率、强阳性率均无显著差异(P均＞0.05)。交界性与正常卵 巢比较，在阳性率上无显著差异(P=0.19)，而强阳性率存在显著差异(P=0.02)。良性与正常 卵巢在阳性率和强阳性率间无显著差异(P均＞0.05),见表1。
表1 卵巢肿瘤与正常卵巢p16蛋白的表达
| 分组 |
例数 |
p16蛋白表达(例数) |
阳性率
(％) |
强阳性率
(％) |
| - |
+ |
++ |
+++ |
| 正常卵巢 |
12 |
0 |
1 |
3 |
8 |
100.00 |
91.67 |
| 良性 |
34 |
5 |
6 |
6 |
17 |
85.29 |
67.65 |
| 交界性 |
10 |
2 |
4 |
4 |
0 |
80.00 |
40.00 |
| 恶性 |
89 |
60 |
18 |
11 |
0 |
32.58 |
12.36 |
注≥（＋＋）为强阳性2.2 卵巢恶性肿瘤临床病理特征与p16蛋白表达的关系
2.2.1 p16蛋白表达与病理类型无关(P＞0.05)。
2.2.2 上皮性组晚期患者p16阳性率、强阳性率均低于早期(P值分别为0.013和0.0004);残 存癌灶≥2cm者，p16阳性率低于残存癌灶＜2cm者(P=0.008)，而两组在强阳性率上差异不显 著(P=0.075)。
2.2.3 在上皮组中，p16的表达与分化程度、淋巴结转移无关，P均大于0.05。见表2。
表2 恶性卵巢肿瘤临床病理特征与p16蛋白表达的关系
| 类别 |
例数 |
p16蛋白表达(例数) |
阳性率
(％) |
强阳性率
(％) |
| - |
+ |
++ |
+++ |
| 病理类型 |
|
|
|
|
|
|
|
| 上皮性 |
73 |
47 |
16 |
10 |
0 |
35.62 |
13.70 |
| 非上皮性 |
16 |
13 |
2 |
1 |
0 |
18.75 |
6.25 |
| 分化程度 |
|
|
|
|
|
|
|
| 高 |
17 |
10 |
2 |
5 |
0 |
41.18 |
29.41 |
| 中 |
26 |
16 |
7 |
3 |
0 |
38.46 |
11.54 |
| 低 |
23 |
17 |
5 |
1 |
0 |
26.09 |
4.35 |
| 手术分期 |
|
|
|
|
|
|
|
| Ⅰ |
11 |
3 |
2 |
6 |
0 |
72.72 |
54.55 |
| ≥Ⅰ期 |
62 |
44 |
14 |
4 |
0 |
29.03 |
6.45 |
| 残存癌灶 |
|
|
|
|
|
|
|
| ＜2cm |
29 |
14 |
8 |
7 |
0 |
51.72 |
24.14 |
| ≥2cm |
31 |
25 |
4 |
2 |
0 |
19.35 |
6.45 |
| 淋巴结转移 |
|
|
|
|
|
|
|
| 阴性 |
40 |
21 |
11 |
8 |
0 |
47.50 |
20.00 |
| 阳性 |
15 |
12 |
2 |
1 |
0 |
20.00 |
6.67 |
注≥（＋＋）为强阳性2.3 生存分析
对73例上皮性卵巢癌用Cox比例风险模型进行单、多因素生存分析，将年龄、手术分期、分化、残存癌灶、淋巴转移、p16等代入Cox模型，发现只有手术时肿瘤分期是影响预后的因素，回归系数估计值1.408，P＜0.001。
3 讨论
p16基因自1993年被美国冷泉港实验室首次报告以来，引起了科学界的广泛关注，该基因位于人第九号染色体的9p21区，含有3个外显子和2个内含子，全长8.5Kb，编码了一个由148个氨基酸组成的蛋白质。p16基因的功能主要是通过其产物p16蛋白实现的，p16蛋白通过竞争性地与CDK4,6结合，抑制后者的激酶活性，通过控制G1期启动影响细胞的增殖[1～3]。
p16在卵巢肿瘤发生中所起到的作用报道不多，结论很不一致。Shih等研究表明在上皮性卵巢肿瘤中p16基因突变罕见，认为p16基因在卵巢肿瘤的发生中作用甚微[4]。而Dong等认为p16的高表达与肿瘤的进展和不良预后有关[5]。Ichikawa发现在晚期卵巢癌中p16失活率明显高于早期，推测p16失活可能与晚期肿瘤的进展有关[6]。
本实验结果显示：卵巢肿瘤与正常卵巢相比，p16蛋白的表达有显著差异。正常卵巢表达率100％，良性、交界性、恶性组表达率则显示下降趋势，表明p16表达的缺失与卵巢肿瘤细胞恶性转化的程度呈平行关系，推测p16基因的失活与卵巢癌的发生、发展有关。检测p16蛋白的表达在判断卵巢肿瘤的恶性程度上可能有一定意义。我们还发现：p16蛋白的表达与组织类型、组织分化的程度、淋巴结转移无关，也有学者认为p16蛋白的异常与组织分化程度相关[７]。本文晚期患者p16表达明显低于早期，残存癌灶≥2cm者p16表达明显低于残存癌灶＜2cm者。提示p16基因的异常所造成的p16蛋白表达降，直接影响了它控制细胞周期进程的作用，从而导致肿瘤的进展。这一点与Ichikawa等[6]研究一致。本文应用Cox模型进行了生存分析未发现p16与预后有关，但因本实验例数尚少，p16是否能够作为卵巢癌的预后因素，尚需进一步研究。
由于p16是人类发现的第一个最直接抑制肿瘤发生的固有成分，而且p16分子量小，因而有可能应用人工合成的p16基因去替代癌患者体内的突变p16基因，另外也可以通过增加患者体内p16蛋白，加强对CDK4的竞争性结合，达到阻止癌细胞增殖的目的。因而p16的发现有可能为卵巢癌的治疗提供一个新思路。
参考文献
［1］Hirama T,Koeffler HP. Role of the cyclin－dependent kinase inhibitor in the development of cancer. Blood,1995,86(3):841～5
［2］Marxs J. New tumor suppressor may rival p53. Science,1994;264:344
［3］赵利淦,林剑,Lee,等.肿瘤抑制基因研究新进展.国外医学分子生物学分册,1995;17(4):160～3
［4］Shih YC,Kerr J,Lin J,et al. Rare mutation and no hypermethylation at CDK2 locus in epithelial ovarian tumor. Int J Cancer,1997;70(50):508～ 11
［5］Dong Y,Walsh M,Mcguckin M,et al. Increased expression of cyclin－ dependent kinase inhibitor2 (CDKN2A) gene product p16INK4A in ovarian cancer is associated with progression and unfavorable prognosis. Int J Cancer,1997;71(1):57～ 63
［6］Ichikawa Y,Yoshida S,Koyama Y,et al. Inactivation of p16/CDKN2 and p15/MTS2 genes in different histological types and clinical stages of primary varian tumors. Int J Cancer,1996;69(6):466～ 70
［7］Fujita M,Enomoto T,Haba T,et al. Alteration of p16 and p15 gene in common epithelial ovarian tumors. Int J Cancer,1997;74(2):148～ 55
(1999－04－14收稿)
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