微卫星不稳定性和杂合性丢失与宫颈癌相关性的研究

肿瘤防治杂志 2000年第4期第17卷 基础研究

作者：温培娥　崔树龄　刘乃富　孙亚梅　崔正言

单位：温培娥　崔树龄(山东省医学科学院基础所　济南市　250062)；刘乃富(山东省肿瘤防治研究院　济南市　250117)；孙亚梅(山东省诸城市人民医院　诸城市　262200)；崔正言(山东省医学科学院基础所　济南市　250062)

关键词：子宫颈癌；微卫星DNA；微卫星不稳定性；杂合性丢失

　　【摘要】目的：探讨染色体微卫星不稳定性(MSI)及杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)在宫颈癌的发生及发展的相关性。方法：运用p53(D17S786)、9p21(D9S171)2对微卫星标志，结合PCR银染技术，分别检测48例宫颈癌组织、癌旁组织及周围静脉血DNA的MSI(microsatellite instability)和LOH及其与临床分期和病理分级的关系。结果：48例宫颈癌组织的2个位点进行了微卫星MSI和LOH多态性分析，分别为56%、25%，临床病理分级(P＜0.05)，不同病理分级的统计学分析差异有显著性。结论：p53(D17S786)、9p21(D9S171)2个不同的位点17号、9号染色体上存在的抑癌基因的失活以及微卫星不稳定性可能在宫颈癌的发生发展中起重要作用。

　　中图分类号：R737.33　　文献标识码：A

　　文章编号：1009-4571(2000)04-0377-04

The Relationship of MSI and LOH to Cervical Carcinoma and its Clinically Biological Significance

WEN Pei-e,CUI Shu-ling,LIU Nai-fu,et al.

　　(Shandong Academy of Medical Sciencers,Jinan 250062)

　　【Abstract】Objective:To elucidate the relationship of MSI and LOH in cervical carcinoma.Melhods：adjacent noncancerous tissues and peripheral vein blood as well as clinical stages and pathological grades were detected using p53(D17S786) and 9p21 (D9S171) as two microsatellite merkers and PCR-based silver staining technology.Results:The microsatellite polymorphism analysis in 48 cases of cervical carcinoma tissues showed that the positive MSI and LOH are 56% and 25% respectively.Clinically pathological grades showed significant difference in statistical analysis.Conclusions:The tumer suppressor gene inactivation on the two different Loci p53 (D17s786) and 9p21 (D9S171) on chromosomes 17 and 19 and MSI may be important factors in the genesis and development of cervical carcinoma.

　　【Key words】cevical caranoma;microsatellite DNA;MSI;LOH

　　近年随着分子生物学技术的飞速发展，已认识到癌基因及癌抑制基因的异常改变在人类恶性肿瘤的发生发展中起着重要的作用，尤其是癌抑制基因功能丧失越来越受到人们的重视。利用微卫星标记位点进行染色体杂合性丢失(LOH)分析技术，已成为癌抑制基因重要的筛选手段之一^［1］。微卫星不稳定性(MSI)的异常改变揭示基因组不稳定性，反映了DNA修复系基因异常。这一改变表现在多种遗传性及非遗传性肿瘤。我们分析了48例宫颈癌17号、9号染色体的LOH及MSI改变，进而准确定位并发现这些区域可能隐含的肿瘤抑制基因TSG(tumor suppressor gene)，结果报告如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　临床资料

　　48例病人中，18例宫颈癌及癌旁组织取自手术标本，由山东医科大学附属医院提供。30例宫颈癌活检组织及外周血由山东省肿瘤防治研究院提供。6例正常宫颈组织取自子宫肌瘤全切术均由山东医科大学附属医院提供。液氮冻存，均经病理证实并有完整临床资料。年龄在31～74岁，平均55.1岁。临床分期按FIGO分期法^［2］Ⅱ～ⅢA期8例，ⅢB期40例。组织病理分级依三步分级法，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别为10例、34例、4例，其中宫颈鳞癌40例，宫颈腺癌8例。

　　1.2　DNA提取

　　宫颈癌组织和癌周组织DNA提取按常规^［3］蛋白酶K消化，酚—氯仿—异戊醇抽提法。外周血淋巴细胞DNA提取按Erlich介绍的细胞裂解/蛋白酶K抽提DNA^［4］，紫外分光光度法定量后，稀释为100 ng/μl,-20℃保存备用。

　　1.3　PCR扩增

　　2个多态微卫星标记p53(D17S786)、9p21(D9S171)杂合性丢失和微卫星不稳定性检测试剂盒购自杭州康壮生物公司，引物序列见表1。

表1　引物序列

　　PCR扩增体系　总体积30 μl，其中2×PCR Buffer 15 μl，引物1和2各1 μl，Taq 酶0.4 μl，dNTP 1.0 μl，模板 DNA 2 μl(0.5～1 μg)，去离子水补至30 μl，石蜡油覆盖。循环参数：94℃热变性5 min，后按94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1 min顺序扩增32次循环后，72℃延伸5 min。

　　1.4　PAUGE电泳

　　按常规方法配制8%的聚丙烯酰胺尿素(交联度为5%)。1×TBE/120～150 V电压预电泳30 min。取PCR产物8 μl加等体积变性载样缓冲液(含95%甲酰胺，5m MEDTA，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青)经98℃变性10 min后置冰水浴10 min，混匀后上样，120 V电压下电泳1.5 h。

　　1.5　DNA显色

　　银染凝胶用银染方法，经固定、染色、显色和终止4个步骤，用Gel Dos 1 000凝胶图象分析仪扫描成像及观察结果。

　　1.6　结果判定

　　宫颈癌组织PCR产物的电泳条带与癌周组织及外周血相比，某一等位基因条带消失记录为LOH。宫颈癌组织PCR产物的电泳条带与癌周组织及外周血相比，出现等位基因条带的增多或长度大小的改变记录为MSI。2　结果

　　48例宫颈癌标本(宫颈癌手术组织和癌旁组织18例，宫颈癌活检组织及外周静脉血30例)。6例正常宫颈组织。对48例宫颈癌组织的2个位点进行了微卫星的LOH和MSI多态性分析，明确这些染色体变化情况。

　　p53(D17S786)、9p21(D9S171)2个位点的LOH和MSI结果，均为CA碱基重复，且位于17号、9号染色体短臂上(17p13、9p21)，结果见图1，不同位点的LOH和MSI频率见表2。

图1　LOH和MSI结果

　　M：分子量；一：正常宫颈组织；N：癌旁组织；

　　T宫颈癌组织；LOH：杂合性丢失；MSI：微卫星不稳定性

表2　两个多态位点LOH、MSI结果

　　注：信息个体指同标本的癌组织及用于对照非癌组织来源的基因组均成功扩增，并呈杂合状态。2.3　临床分期与LOH和MSI的关系

　　对48例病人按临床分期进行分组，LOH和MSI的结果示：LOH和MSI在两组中的差异无显著性(表3)。

表3　不同临床分期LOH、MSI结果

　　注：只要有一位点有LOH限为阳性，MSI规定相同。2.4　临床病理组织学分类与LOH和MSI的关系

　　对48例病人按临床病理组织学分组，LOH和MSI的结果示：LOH和MSI在两组中的差异具有显著性，MSI多出现在腺癌的患者(表4)。

表4　不同组织学分类LOH、MSI结果

　　2.5　临床病理分级与LOH和MSI的关系

　　对48例病人按临床病理分级，LOH和MSI的结果示：LOH和MSI在两组中的差异有显著性，充分提示LOH和MSI较多出现在病期较晚的低分化的患者中(表5)。

表5　不同病理分级LOH、MSI结果

　　3　讨论　　自1981年Miesfeld等^［5］发现微卫星DNA，Altonee等^［6］于1993年在遗传性非息肉样结直肠癌中发现微卫星不稳定性以来，人们又在很多肿瘤发现了MSI和LOH。Mitra在对14例宫颈癌前病变和5例宫颈癌原位癌的分析发现5号染色体D5S406位点的MSI阳性率高达66.7%，提示该位点的MSI可能成为宫颈癌变的早期分子标志。宫颈癌是常见的恶性肿瘤之一，其病因和发病机理至今尚未阐明，临床上也缺乏判断其恶性程度的实用指标，使现有的预后及治疗措施带有较大的盲目性。目前，虽有一些从分子水平上研究宫颈癌发生机制的报道，且国内对p53(D17S786)、9p21(D9S171)杂合性丢失和微卫星不稳定性的报道甚少，本文应用PAUGE—DNA银染方法，而检测染色体等位基因的丢失和微卫星不稳定性是发现抑制基因的有效途径之一。

　　对照48例宫颈癌组织和6例正常子宫肌瘤全切术组织，探讨宫颈癌组织PCR产物的电泳条带与周围组织及外周血相比，对p53(D17S786)、9p21(D9S171)2个位点进行微卫星多态性分析，结果在48例宫颈癌组织中进行了2个位点杂合性丢失(LOH)和微卫星不稳定性(MSI)的多态性检测，有27例杂合性丢失，有12例微星不稳定性，阳性率分别为56%(27/48)、25%(12/48)，与国外报道相似^［7］，提示这2个位点附近存在宫颈癌易感基因，支持该区域存在肿瘤抑制基因的论断，与国内张国玲等^［8］报道的近似。同时检测了癌旁组织外周血淋巴细胞DNA及正常宫颈组织，均未见阳性，充分证明了微卫星不稳定性和杂合性丢失仅在肿瘤组织发现，未在与肿瘤相邻的正常组织及周围血白细胞中发现^［8］。在原发性肿瘤与转移肿瘤中，微卫星不稳定和杂合性丢失均匀分布于整个肿瘤，这提示微卫星不稳定性和杂合性丢失是在肿瘤细胞克隆之前或刚克隆之时发生的现象，在肿瘤细胞转移过程中不会发生。

　　p53(D17S786)、9p21(D9S171)2个位点的LOH和MSI在宫颈癌组织不同的临床分期分别为75%、52%和12%、28%，表明各期LOH和MSI的关系差异无显著性(P＞0.05)。不同组织学分类，48例宫颈癌患者，鳞癌占40例，腺癌占8例，2个位点LOH和MSI的阳性率分别为52.5%、75%和15%、75%，MSI组高于LOH组(P＜0.05)，2组差异有显著性，可见MSI较多的出现在腺癌的患者中。不同的病理分级在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的LOH和MSI阳性率分别为30%、59%、100%和10%、24%、75%，可见2个位点多态性分析阳性率与病理分级和病理组织学分类呈正相关，统计学分析，Ⅰ级和Ⅱ级，Ⅰ级和Ⅲ级之间差异均有显著性(P＜0.05)，提示2位点杂合性丢失和微卫星不稳定性，在宫颈癌的演变过程中起着重要的作用，不是宫颈癌的首发原因，是导致肿瘤恶性程度提高的继发原因。最近文献报道在宫颈癌中也经常出现等位基因的丢失^［9～11］。Park等^［9］报道40%宫颈癌发生在17号染色体上，与本研究结果基本相符。由此可见，准确检测LOH和MSI发生关系有利于对宫颈癌预后作出客观的估计，从而对治疗方案的选择提供依据，具有重要的临床意义。

　　参考文献：

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　　［8］张国玲，杨慧娟，许凯黎，等.卵巢癌及宫颈癌中17p13.3的杂合性丢失［J］.中华肿瘤杂志，1997，19(6)：401～403.

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　　［10］Mitra AB,Murty V S,Li R G,et al.Allelotype andalysis of cervical carcinoma［J］.Cancer Res,1994,54:4481～4483.

　　［11］Kaelbling M,Burk RD,Atkin NB,et al.Loss of heterozygosity on chromosome 17p and mutant P53 in HPV-negative cervical carcinoma［J］.Lancet,1992,30:140～143.

收稿日期：2000-04-12

修回日期：2000-05-24