大蒜油对小鼠腹水型宫颈癌细胞及其DNA聚合酶α活性的影响

中药新药与临床药理 1999年第5期第10卷 药效与毒理学研究

作者：陈双厚　吴志奎　黄霞珍　谢锦玉　刘铭福

单位：陈双厚　吴志奎　黄霞珍（中国中医研究院广安门医院，北京100053）；谢锦玉　刘铭福（中国中医研究院基础研究所，北京100700）

　　关键词： 大蒜油；腹水型宫颈癌细胞；药物作用；DNA聚合酶α；药物作用

　　摘要：在证明大蒜油具有明显提高小鼠抑瘤率实验研究的同时，应用DNA聚合酶活性测定技术检测了小鼠腹水型宫颈癌细胞DNA聚合酶α活性。结果发现大蒜油能使腹水型宫颈癌细胞DNA聚合酶α活性降低，提示其可能是通过阻滞癌细胞DNA的合成和复制，起到抑制癌细胞增殖的作用。

　　中图分类号：R285.5；R730.52　　文献标识码：A　　文章编号：1003-9783(1999)05-0286-02

　　大蒜油是我国人民常用食品，具有很强的抑菌杀菌作用。民间作为药用已有几千年的历史，近年来国内外学者研究又发现大蒜油还有良好的防癌抗癌作用^［1～4］，但作用机理尚不清楚，有待深入研究^［5，6］。本文对大蒜油乳剂进行了抑瘤和对DNA聚合酶α活性影响的实验研究，结果报道如下。

　　1　材料

　　1.1　药物及配制　大蒜油(G)、红毛五加多糖(A)，均由中国中医研究院基础理论研究所提供，4℃冰箱保存。大蒜油乳剂配制：G1g，吐温-802g，加蒸馏水至100mL。

　　1.2　动物及癌株　实验选用昆明种♂小鼠，体重20～22g，购于中国医学科学院动物中心，合格证书：医动字第01-3001号，为二级动物。U₁₄癌株由中国中医研究院中药所提供。

　　1.3　主要试剂　³H-胸腺嘧啶核苷三磷酸(³H-TTP)放射比强度1.74TBq/mmol(25Ci/mmol)，英国Amersham公司产品；脱氧核苷三磷酸dATP、dGTP、dCTP，二巯基苏糖醇(DTT)，均为美国Sigma公司产品；小牛胸腺DNA，纯度98%，英国Serva公司产品；DNA聚合酶α标准品，500u/50μL，华美生物技术工程公司产品；2，5-(二苯基恶唑)苯，1，4-双-2(5-苯基恶唑)苯，均为进口分装，上海化学试剂采购供应站试剂厂；小牛白蛋白，中国科学院上海生化研究所生产。

　　1.4　仪器　501型超级恒温水浴器，上海实验仪器厂产品；SCR20BA型高速冷冻离心机，日本日立公司产品。1217型LKB液体闪烁计数器，芬兰产品。玻璃组织匀浆器，国产。

　　2　方法与结果

　　2.1　对小鼠U₁₄癌细胞增殖的影响

　　小鼠一次ip接种1×10⁷个细胞/只，于接种后第3天随机分成3组，即：对照组、大蒜油组(100mg/kg)、复方大蒜油组(G100mg/kg+A100mg/kg)，并开始ip给药。对照组给等体积的生理盐水(0.2mL/只)。每天给药一次，连续3d。于ip给药第81h、105h、129h分别将动物放血处死，剪开腹腔以生理盐水冲洗，收集腹水约5mL左右，以1200r/min低温(5℃)离心洗涤二次，计癌细胞的体积；然后用冷生理盐水(5℃)定容至5mL。取20μL稀释进行癌细胞计数。结果表明：大蒜油组(G)和复方大蒜油组(G+A)腹水癌细胞增殖数明显低于生理盐水组。说明大蒜油有明显的抑制U₁₄癌细胞增殖的作用。见表1。

　　收稿日期：1999-06-04

表1　大蒜油对小鼠U14癌细胞增殖的影响

　　注：与对照组比较，^*P＜0.001。2.2　对小鼠U₁₄癌细胞DNA聚合酶α活性的影响

　　将上述洗涤二次的腹水癌细胞液离心，弃上清，收集癌细胞，加入DNA聚合酶匀浆液进行细胞匀浆，用高速冷冻离心机16000r/min低温(5℃)离心60min。取上清液测定DNA聚合酶α的活性^［7］。测定方法：缓冲液(50mmolTris/HCl,pH7.5，8mmolMgCl₂·6H₂O，1mmolDTT)，4μg活化小牛胸腺DNA(水浴煮沸7min)，6μgdATP、6μgdGTP、6μgdCTP,1μCi　³H-TTP(95C.P.M/pmol)，加癌细胞匀浆离心上清液10μL，测定系统总体积为100μL。实验同时设DNA聚合酶α标准管，置于37℃水浴保温60min。加入10%三氯乙酸1mL停止反应，分别将样品小心滴入49号玻璃纤维滤膜上抽滤，用10%三氯乙酸1mL洗涤二次，分别用70%及90%乙醇10mL各洗涤一次(脱水)，置于烤箱中(70℃)烘干。将滤膜片移入装有5mL苯系统闪烁液(ppo7g+popop0.5g加二甲苯至1000mL)的闪烁杯内，用液体闪烁仪进行放射性测量。采用Lowry方法测定癌细胞匀浆液蛋白质含量^［8］，用小牛白蛋白作为蛋白质定量的标准。计算出100mg蛋白质中的酶活性，结果进行统计学处理(t检验)。

　　实验结果表明：大蒜油组(G)和复方大蒜油组(G+A)DNA聚合酶α的活性明显低于生理盐水组。说明大蒜油有明显的抑制DNA聚合酶α活性的作用，从而达到抑制DNA合成的目的。见表2。

表2　大蒜油对小鼠U₁₄癌细胞

　　DNA聚合酶α活性的影响

　　注：与对照组比较，^*P＜0.001。3　讨论

　　国内学者研究^［9］证明，大蒜油能提高小鼠生命率和有一定的抑瘤作用，并应用流式细胞术(FCM)分析了大蒜油作用机理。目前，一般认为癌细胞的生存和增殖主要靠DNA的合成，而DNA的合成需要三个条件，即底物、四种脱氧核苷酸、模板DNA，它们在聚合酶α作用下合成DNA，而抗肿瘤药物有抑制DNA合成的作用，其作用靶子有两种可能：一是作用于DNA聚合酶本身；二是作用于模板，与模板结合或相嵌^［10］。本实验表明，大蒜油组(G)能明显抑制DNA聚合酶α的活性，从而提示这一机理参与抑制了小鼠腹腔U₁₄细胞增殖。这也进一步说明了大蒜油对癌细胞作用的某些机理。

　　参考文献：

　　［1］潘希愚，李风琴，谢根法.生大蒜匀浆、二烯丙三硫和三种抗癌药对胃癌细胞株的剂量效应比较［J］.中华肿瘤杂志，1985，7(2)：103.

　　［2］湖南医学院大蒜液抗癌研究协作组.大蒜提取液抗癌作用体外实验的初步报告［R］.湖南医学院医学研究资料，1997.

　　［3］Belman S.Ontion and garlic oils inhibittumer promotion［J］.Carcinogensis, 1983,84:1063.

　　［4］Wargovich MJ.Dially sulfide,a glavor component of garlic(AlliumSativum),inhibits dimethylhydrazine induced coloncancer［J］.Carcinogensis,1987,8(3):487.

　　［5］刘永久.大蒜的研究及其制剂的开发［J］.医学情报，1988，10：28.

　　［6］陶文洪.肿瘤防治中的大蒜研究［J］.国外医学肿瘤分册，1986，3：146.

　　［7］邱长春，吴冠芸，吴志奎.腹水癌细胞DNA聚合酶α的纯化及其性质的研究［J］.中国医学科学院学报，1984，(4)：12.

　　［8］Lowry,O.H.Rosebrough,H.J.Farr.A,Land Randall.R.J.1951 protein measurement with the Folinphenol reagent［J］.Biolchem，1983:265.

　　［9］谢锦玉，高玉民，沈联慈，流式细胞术分析大蒜油对癌细胞DNA合成及细胞周期的影响［J］.中西医结合杂志，1992，12(2)：92.

　　［10］陈双厚，吴志奎，刘凤云.“天仙丸”对DNA聚合酶α及DNA模板活性的影响［J］.新疆中医药，1990，(1)：43.

收稿日期：1998-07-20