NO对大鼠睡眠-觉醒的调节

中国应用生理学杂志 2000年第4期第16卷 研究论文

作者：张文慧　孙碧英　林殷利

单位：上海第二医科大学生理教研室，上海　200025

关键词：侧脑室微量注射；L-NAME；L-精氨酸；睡眠-觉醒；NO

　　摘要 目的和方法：通过对大鼠侧脑室微量注射NOS抑制剂L-NAME及NO的前体L-精氨 酸(L-Arg)观察两种物质对大鼠睡眠-觉醒的影响。结果：注射1 mg L- NAME(5 μl)后4 h觉醒(W)明显增加，尤以注射后第1～2 h显著；4 h慢波睡眠(SWS)明显减 少，该效应同样以注射后第1～2 h显著；异相睡眠(PS)无明显变化。小剂量L-NAME(0．2 mg，5 μl)对大鼠的W、SWS、PS无明显影响；同样方法注射NO前体L-Arg 300 μg／5 μl 3～4 h后W明显减少而SWS显著增加；大鼠侧脑室注射L-Arg(300 μg／5 μl)+L-NAME(1 mg／5 μl)后，W、SWS及PS无明显变化。结论：L-NAME通过抑制NOS使 大鼠W增加，SWS减少，这一作用可被NO前体L-Arg所拮抗，说明NO参与了机体睡眠-觉醒的 调节。

　　中图分类号：　R338．63文献标识码:A

　　文章编号:1000-68 34(2000)04-0339-04

THE REGULATION OF NO ON

　　SLEEP-WAKEFULNESS IN RATS

ZHANG Wen-Hui　SUN Bi-ying　LIN Yin-li

　　（Department of Physiology,Shanghai Second Medical University,Shan ghai 200025）

　　ABSTRACT　　Aim and Methods:The effects of an inhibitor of nitric oxide synthase L- NAME and a precursor of NO(L-arginine) on sleep-wakefulness in rats were exami ned. Results: ① The time of waking was increased(P＜0.01) a nd the time of SWS was decreased(P＜0.01) during the first two hours after in jection intracerebroventricularly(i.c.v.) of L-NAME 1 mg,this effect was showed across the 4 h recording period(P＜0.05).The i.c.v. injection of L-NAME 0.2 mg had no significant effect.② The　time of waking was su-ppressed during the third and fourth hours after i.c.v.injection of L-arginine 300 μg(P＜0 .05).At the same time the increase of SWS was observed (P＜0.01).③There was no change on W,SWS,PS when L-NAME 1 mg was given after administration of L-arg inine.Conclusion: The excitatory effect of L-NAME on wakefulness is mediated by inhibition of NOS.This effect could be antagonized by L-arginine . It suggests that NO is involved in regulation of sleep-wakefulness.

　　KEY WORDS:　injection intracerebroventricularly;　L-NAME;　 L-arginine;　sleep-wakefulness;　NO

　　近年来大量研究表明，NO作为一种神经信使在中枢和外周发挥特有的生理效应。在中枢 神经系统存在大量NOS^［1］，体内NO可由L－精氨酸(L-Arg)，在NO合酶(NOS)的作用 下转化而成。NO产生后可激活鸟苷酸环化酶而使cGMP水平上升，最终产生平滑肌舒张等一系 列作用。到目前为止，一些实验发现中枢神经系统内NO对机体的睡眠－觉醒也有影响，但具 体的作用尚不十分肯定，如Dzoljic和DeVries^［2］腹腔注射NOS抑制剂L-NMMA发现L -NMMA对大鼠的觉醒具有抑制作用，从而提出中枢神经系统中NO对机体的觉醒有直接兴奋作 用。而Levente却认为NO可维持大鼠正常的睡眠－觉醒活动^［3,4］，尤其表现在有助 睡眠方面。本实验室多年来已掌握了一整套多导睡眠记录的方法，鉴于上述矛盾结果，我们 拟通过选用NOS抑制剂L-NAME及NO前体L-Arg对大鼠作侧脑室微量注射并记录大鼠睡眠-觉 醒周期，以期进一步探讨NO对大鼠睡眠－觉醒的确切影响。

　　1　材料与方法

　　1．1　动物手术

　　实验采用SD雄性大鼠19只，体重200～300 g，1％戊巴比妥钠40 mg／kg麻醉，将大鼠固定 于定向仪上，暴露颅骨，根据Paxinos和Watson图谱于左侧脑室(Ap-0．92，RL　1．6，H3 ．7)插入微量注射用不锈钢外套管(Φ0．4 mm)，内置比外套管长0．5 mm的不锈钢丝以防 脑脊液外流。分别于冠状缝前1 mm，右侧旁开2 mm，和矢状缝左右旁开3 mm，冠状缝后3～4 mm安置脑电电极，以不损伤硬脑膜为准；肌电电极由银丝制成，外套细塑料管以防互相干 扰，分别置于左侧颈部浅、深肌层和右侧颈深肌层；所有脑电、肌电电极和微量注射用外套 管均用磷酸锌粘固粉固定于颅骨表面，将脑电和肌电电极焊接到一插件上。术后大鼠自由活 动，饮食不限，分笼饲养于半隔音、恒温(22±2℃)，人工光照(6:00～18：00)的实验室中 。术后一周开始记录大鼠的脑电及肌电。脑电和肌电信号通过信号收集器输入8道脑电图机( 上海医用电子仪器厂出品)。

　　1．2　微量注射用药物

　　对照液为pH7．0的NS，L-NAME(sigma公司产品)以pH7．0的NS为溶剂，分别配置两种浓度 1 mg／5 μl和0．2 mg／5 μl，L-Arg(sigma公司产品)同样用pH7．0的NS配置，浓度为 300 μg／5 μl。

　　1．3　侧脑室微量注射方法

　　任大鼠自由活动，每次注射剂量5 μl。注射时拔去针芯，将微量注射管(Φ0．2 mm不锈 钢管)插入注射外套管，微量注射管通过细塑料管与5 μl微量注射器相连。注射缓慢，注射 完毕后留针约1 min，再次插入不锈钢内芯。注射于上午9：30开始，30 min内注射完毕，10 ：00开始记录，连续记录4 h。每次实验随机注射NS或测试液。注射L-NAME　1 mg后一天不 作微量注射，但记录脑电及肌电2 h(10：00～12：00)以观察它的后作用。L-Arg和L-NA ME联合注射时先注射L-Arg　300 μg，15 min后再注射L-NAME 1 mg，同样30 min内注射 完毕。

　　1．4　资料分析

　　结合脑电和肌电分析大鼠睡眠-觉醒的3个时相。觉醒(W)：脑电为低幅快波伴明显肌电； 慢波睡眠(SWS)：脑电呈高幅慢波或梭形波，肌电明显减少或消失；异相睡眠(PS)：脑电呈 有规律的波幅较一致的快波，肌电完全消失或仅偶有肌电活动。

　　1．5　微量注射管定位鉴定

　　实验结束后以0．9％生理盐水30～50 ml和10％福尔马林50～100 ml灌流取脑，脑组织浸 于10％福尔马林中固定。用半导体冰冻切片机将脑切成厚为25 μm的脑片，参照Paxinos和W atson图谱，借助光学显微镜判定微量注射管定位。

　　1．6　数据处理

　　累计每小时的W、SWS、PS的时间并按每2 h统计分析，另做4 h总和分析，数据用均数±标 准差(±s)表示，作同体实验前后比较的t检验。

　　2　结果

　　2．1　L-NAME对大鼠睡眠-觉醒的影响

　　L-NAME 1 mg(n＝8)注射后第1～2 h大鼠W显著增加(P＜0．01)，SWS显著减少 (P＜0．01)；注射后第3～4 h上述变化不明显；总计4 h的W明显增加(P＜0．05)， SWS明显减少(P＜0．05)；注射L-NAME 1 mg后大鼠的PS呈减少趋势(表1)。每次注射后 均见大鼠出现明显的兴奋症状。注射后一天脑电和肌电记录显示大鼠的W、SWS、PS基本恢复 正常。

Tab．1 Effect of L-NAME(1 mg，i．c．v．)on sleep

　　and wakefulne ss(±s，n＝8)

　　^*P＜0.05, ^**P＜0.01 comp ared with NS group　　实验结果显示L-NAME 0．2 mg(n=9)对大鼠的W、SWS、PS无明显影响(表2)；注射后无 明显行为变化。

Tab．2 Effect of L-NAME(0．2 mg，i．c ．v．)on sleep

　　and wakefulness(±s，n=9)

　　2.2　L-Arg及L-Arg+L-NAME对大鼠睡眠－觉醒的影响

　　注射L-Arg 300 μg(n＝4)后第1～2 h和总计4 h的W、SWS、PS变化不明显，但注 射后第3～4 h可见W明显减少(P＜0．05)，SWS显著增加(P＜0．01)，PS无明显变化 。联合注射L-Arg 300 μg和L-NAME 1 mg(n＝4)后大鼠的W、SWS无明显变化，PS也无 明显变化，未见到单独注射L-NAME 1 mg后所引起的W增加而SWS减少的效应(表3)。

Tab.3 Effect of L-Arg(300 μg，i.c.v)and

　　L-Arg+L-NAME(1 m g，i.c.v.)on sleep

　　and Wakefulness(±s，n＝4)

　　^*P＜0.05, ^**　P＜0.01 compare d with NS group2.3　微量注射管定位

　　实验后参照Paxinos和Watson图谱在光学显微镜下观察微量注射管定位基本准确。

　　3　讨论

　　本实验通过侧脑室微量注射NOS抑制剂L-NAME后发现，大剂量L-NAME(1 mg)引起大鼠 觉醒(W)增加，慢波睡眠(SWS)减少，异相睡眠(PS)呈减少趋势；这一效应尤以注射后第1～2 h显著，并持续4 h。但注射后第二天大鼠的睡眠－觉醒周期基本恢复正常。这一实验结果 与Levente Kapas等^［3］实验结果相一致。他们给大鼠脑室注射L-NAME　1 mg后同 样发现注射后头2 h SWS明显减少，分别减少了67％和40％，而且这一作用在注射后6 h一直 存在。已经证明，在中枢神经系统内很多与睡眠有关的中枢结构均有NOS^［5］，如 下丘脑，嗅结节，中脑，脑桥被盖区等，所以我们认为L-NAME对大鼠睡眠-觉醒的影响可 能是通过抑制脑内与睡眠有关的神经元内NOS造成内源性NO减少所致。我们在注射小剂量L- NAME(0．2 mg)后发现大鼠的睡眠-觉醒周期并无明显改变，这说明L-NAME对大鼠的睡眠 -觉醒的调节具有剂量-效应关系。

　　为了进一步证实上述推断，我们又在侧脑室内注入NO前体L-Arg，也联合注射L-Arg和 L-NAME，以观察大鼠的脑电和肌电变化。尽管有人认为在正常条件下L-Arg并不改变机体 的睡眠-觉醒周期，如Dzoljic等脑室注射L-Arg后并未出现大鼠睡眠－觉醒的变化^{［2 ］}，但我们在实验中发现，侧脑室微量注射L-Arg 300 μg后第3～4 h大鼠W明显减少而S WS显著增加，而注射后第1～2 h及总计4 h的W、SWS无明显变化，PS基本不受影响。这一结 果与注射L-NAME引起SWS减少的作用相符。Levente 等也曾于脑室微量注射NO的供体SNAP 和SIN-1，结果注射NO供体后大鼠睡眠增加^［6,7］。上述脑室注射L-Arg的结果和 Dzoljic等的实验结果不同，可能与注射的浓度不同有关。当我们联合注射L-Arg和L-NAME 时，注射后头2 h和整个4 h大鼠的W、SWS、PS均无明显变化，而单独注射L-NAME时，在上 述时段中大鼠的W、SWS有明显改变。这说明L-Arg和L-NAME的作用互为拮抗。以上的实验 结果进一步说明L-NAME最终是通过减少脑内NO而产生致觉醒作用，由此我们得出如下结论 即中枢神经系统内NO参与了睡眠-觉醒的调节。

　　那么NO究竟是通过何种机制来发挥它的调节作用的呢?有人认为NO可通过脑内温度的改 变而影响机体的睡眠－觉醒周期。文献认为NO可刺激基底前脑释放Ach^［8］，而基底 前脑、中脑以及脑桥内的胆碱能系统又与机体慢波睡眠及异相睡眠有关^［9］。此外 还有报道提出NO可影响大鼠纹状体内源性多巴胺的释放，而多巴胺也是影响机体睡眠-觉醒 周期的一个重要因素。尽管以上观点已得到某些实验的支持，但NO的作用机制到目前为止还 不十分清楚。

　　总之，我们的工作表明L-NAME可抑制大鼠的SWS，使其W增加，这一作用可被L-Arg所阻 断，提示NO参与了正常睡眠-觉醒活动的调节。

　　作者简介：张文慧(1966-)，女，江苏句容人，讲师，从事睡眠机制研究 。

　　4　参考文献

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收稿日期：1998-12-04

　　修回日期:2000-06-22