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（4）各种致病性感染的病原体检查如PCR。组织学证实的恶性肿瘤，如KS；
（三）HIV抗体检测
1.酶联免疫吸附法（ELISA）；2.明胶颗粒凝集试验（PA）；3.免疫荧光检测法（IFA）；4.免疫印迹检测法（Western
Blot，简称WB法）；5.放射免疫沉淀法（RIP）。其中前三项常用于筛选试验，后二者用于确证试验。HIV感染后数周或数日内常不能检出抗体，95%的受染者在5个月内可测出抗体。但也有感染后3-4年仍不能检出抗体者，此时有必要检测HIV病毒。
（四）PCR技术检测HIV病毒
1．标本的采集与模板核酸的制备。从怀疑为AIDS和ARC患者以及无症状的同性恋者采集血液标本，分成两份，其中一份送往检测实验室与Glyciegel混合进行常规检验或者在-20～-80℃保存。另一份可在冻存之前通过聚蔗糖（Ficoll）离心分离，收集沉积细胞。此法亦适用于疑为HIV感染的母亲及出生6个月以上的新生儿的血液标本。
可采用下述方法自血液标本中分离外周血单核细胞（PMC）：
① 取4ml血液用Hanks液1：1稀释。
② 向含有1份淋巴细胞分离液的试管内轻轻加入两分稀释的血液，勿搅乱分层。
③ 2500r/min离心20min。
④ 吸出介于淋巴细胞分散液和血浆层间的PMC层，再用Hanks液洗两遍。
⑤ 加入RPMI-1640生长液（10%胎牛血清，10%白介素-2，2μg/ml
polyberen 及2.5μg/ml的植物血凝集素P）,使细胞浓度为2×106/ml。
⑥ 置5%CO2的孵箱内于37℃培养2～3d，作为HIV分离的靶细胞。
2．模板核酸的提取。制备PCR模板核酸有多种方法，但其基本原理大致相同，使用的试剂因采取的方法不同而异。这里分别介绍两种从外周血单核细胞中提取DNA和RNA的方法。
（1）从外周血单核细胞中提取DNA
方法A：
① 取1ml经37℃快速解冻的Glyciegel冻存细胞置一支小离心管内。
② 加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。
③ 2500r/min离心10min，弃上清。
④ 沉淀的细胞用PBS洗两次，最后将细胞悬浮在溶液A（100mmol/KCl，10mmol/LTris-HCl，pH8.3）中，使细胞浓度为6×106/ml。
⑤ 加入等体积的溶液B（10mmol/LTris-HCl，pH8.3，2.5mmol/L
MgCl2，10%Tween20，10%NP-40）。
⑥ 于37℃保湿后置冰箱保存。
该方法也适用于无Glyciegel保存的肝素标本及新鲜样品经聚蔗糖-400离心制备的淋巴细胞DNA的提取。
方法B：
① 取4ml经37℃快速解冻的Glyciegel标本。
② 2500r/min离心10min，收集沉淀的细胞，上清液可作血清学研究用。
③ 用10ml0.9%NaCl（含50%葡萄糖）将沉淀的细胞洗一次。
④ 再用10ml
0.9%NaCl（含50%葡萄糖）洗两次。
⑤ 通过聚蔗糖-400离心，分离单核细胞。
⑥ 将单核细胞悬浮于0.5ml裂解缓冲液（10mmol/L，Tris-HCl
pH8.3，10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，0.5%SDS，100μg/ml蛋白酶K）中使细胞裂解。
⑦ 用酚一氯仿抽提两次，将水相转移到一支新的离心管内。
⑧ 加入3倍体积的无水乙醇，于-20℃放置20min，13000r/min离心10min，弃上清，沉淀物经真空干燥后，用100μl蒸H2O溶解，于-20℃保存。
该方法也适用于标本经聚蔗糖-400离心制备的单核细胞DNA的提取。
（2）从外周血单核细胞中提取RNA及其反转录
方法A：
① 5ml血液标本，通过聚蔗糖-400离心制备外周血单核细胞。
② 将细胞悬浮于10mlRPMI-1640离心制备外周血单核细胞。
③ 2500r/min离心20min，收集沉积细胞。
④ 把细胞悬浮于一定体积的预冷的裂解缓冲液（0.4mmol/L
NaCl，10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40）中,使细胞浓度为104/ml。
⑤ 13000r/min，于4℃离心10min，收集上清液。
⑥ 把含有RNA的上清液转移到一支新管内，立即置-80℃保存，备用。
在RNA反转录前，先将RNA样品用DNase处理，除去样品中残留的DNA。经反转录得到的cDNA即可进行PCR扩增。RNA反转录操作如（7）～（9）。
⑦ 取10μlRNA样品加2.7U
DNase I。
⑧ 于37℃保温10min,93℃10min,立即放入冰浴中冷却。
⑨ 另将一份DNase
I处理过的RNA样品，加入RNase A（15μg/份），37℃保温10min，置-20℃保存。
方法B：
① 取5ml新鲜血浆置一支离心管内。
② 40000r/min，4℃离心10min，收集沉淀。
③ 将沉淀物溶于变性液（4.0mmol/L异硫氰酸胍,25mmol/L柠檬酸缓冲液pH7.0,0.5
sarcosyl,0.1mmol/L2-巯基乙醇）中充分混匀.
④ 加入30μl2mmol/L乙酸钠缓冲液pH4.2,400μl酚和80μl氯仿/异戊醇混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min.
⑤ 13000r/min离心20min.
⑥ 轻轻将水相转移到一支新管中.
⑦ 加入3倍体积的无水乙醇,-20℃放置1h左右.
⑧ 13000r/min,4℃离心15min,收集沉淀.
⑨ 沉淀物用75%乙醇洗涤两次,真空干燥.
⑩ 加入10μl
水溶解,立即置-80℃保存或者反转录.
⑾ 取10μl
RNA样品.
⑿ 加入10μl
1×PCR缓冲液(50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris - HCl，pH 8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明胶),各0.2mmol/L四种dNTP,10pmol/GN
GHD QLP GX PUH R XHH TR 39,20URNA酶抑制剂(RNsin),10U的AMV逆转录酶。
⒀ 42℃保温30～60min,然后93℃5min.
⒁ 立即置冰浴中冷却，备用。
由上述方法制得的RNA反转录样品，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳可鉴定其特异性。
三、PCR扩增步骤
（一）引物的设计与合成
HIV
PCR引物设计应遵寻引物设计的一般原则。由于HIV基因易发生变异，因而引物应在保守区内设计，一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列内设计，HIV感染的细胞往往很少，要从106个正常细胞中检出1个HIV感染细胞，PCR扩增的引物首先要具有特异的结合HIV相应基因能力，同时一般要采用巢式-PCR方法，来提高检测的灵敏性。
检测HIV引物的第二步骤就是扩增HIV感染细胞中的原病毒DNA。感染细胞与未感细胞混合得到连续的10倍感染细胞的稀释液。通常由103/106个感染细胞稀释至1/106个感染细胞。同时用其它逆转录病毒感染细胞的DNA作对照，进行PCR扩增。然后通过Southern杂交及DNA序列分析，进一步确定扩增产物的特异性。
已经被确定的保守区是gag，tat，evn，pol基因中的某些核苷酸序列。在用于临床标本检测之前，要对引物的特异性进行鉴定。通常取100pg含有HIV基因组序列的质粒DNA稀释液和2μg载体鲱鱼精DNA。如引物是特异的，它们就会指导单一的双股DNA片段的合成。合成的DNA片段相对应于两引物5′末端之间距离。如果是另一种DNA模板，就不会合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所预期的或除了有所预期的片段还有其它的DNA片段，那么可以考虑对PCR的条件进行某些改进，看是否能改善其特异性，否则要另选引物。
表6-20
用于HIV PCR扩增的引物及探针
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引物
及探针
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序列（5′3′）
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基 因
区
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片段（bp）
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SK38
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ATAACCACCTATCCCAGTAGGATAAAT
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gag
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115(HIV1)
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SK39
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TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC
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SK19(P)
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ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC
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SK145
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AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT
|
gag
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141(HIV1)
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SK101
|
GCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTC
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139(HIV2)
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SK102(P)
|
GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
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|
|
|
SK145
|
AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT
|
gag
|
142(HIV1)
|
|
SK150
|
TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC
|
|
139(HIV2)
|
|
SK102(P)
|
GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
|
|
|
|
O-1
|
GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCAC
|
gag
|
525(HIV1)
|
|
O-2
|
TTTTACCTCCTGTGAAGCTTGCTCGGTC
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|
|
|
I-2
|
TTGGTCCTTGTCTTATGTCC
|
gag
|
422(HIV1)
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I-1
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TTAATACGACTCACTATAGGGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGC
|
|
|
|
GK55
|
CCTGCTATGTCACTTCCCCT
|
gag
|
190(HIV1)
|
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GK56
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TTATCAGAAGGAGCCACCCC
|
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P-1
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TTCTGTCAATGGCCATTGTTTAACTTTTGGGCCAT
|
pol
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355(HIV1)
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P-2
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TAAAGGAAGCAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGCTGA
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SK29
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ACTAGGGAACCCACTGCT
|
Itr
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105(HIV1)
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SK30
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GGTCTGAGGGATCTCTA
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|
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SK31(P)
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ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT
|
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P13
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TGGCGCCCGAACAGGGAC
|
LTR
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168
|
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P14
|
TACCCACGCTCTCGCAG
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|
|
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SK89
|
AGGAGCTGGTGGGGAACG
|
LTR
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165(HIV2)
|
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SK90
|
GTGCTGGTGAGAGTCTAGCA
|
|
|
|
SK91(P)
|
TTGAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCAGGTAG
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SK68
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AGCAGCAGGAAGCACTATGG
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env
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142(HIV1)
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SK69
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CCAGACTGTGAGTTGCAACAG
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SK70(P)
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ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT
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CO1
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ACAATTATTGTCTGGTATAG
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env
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135(HIV1)
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CO2
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AGGTATCTTTCCACAGGCAG
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CO3(P)
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TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAG
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CO71
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TGTGGAGGGAATTCTTCTACTGTAA
|
env
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320(HIV1)
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CO72
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TATAGAATTCACTTCTCCAATTGTCCCTCAT
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CO75(P)
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GAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAA
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（二）PCR扩增步骤
1．扩增条件
当选择的引物影响其特异性和扩增效果时，首先应考虑扩增的条件是否适宜。这些条件包括退火温度，PCR循环数，反应物浓度等。扩增的条件通常是1～4mmol/LMgCl2，0.5～1.0mmol/L
dNTP,每100μl反应体积2～4U Taq DNA聚合酶,2μgBSA,10pg靶DNA,扩增25～30循环,退火温度为37℃,引物浓度6μg/ml。在37～55℃之间变更退火温度可以找到提高产量和特异性的最佳温度.尽管每个实验室使用的扩增条件略有差异,但它们的原理都是相似的。
2.扩增的步骤
(1)取10μl
(1.2μg)HIV-DNA样品。
(2)用10μl
1×PCR缓冲液(100mmol/LTris-HCl pH8.8,500mmol/L KCl，2mmol/L MgCl2,16mmol/L
DTT)。
(3)加入10μl
,各1mmol/LdNTP,6.6μg/ml引物。
(4)反应混合物于93℃变性处理7min。
(5)冷却至室温,加入4U
TaqDNA聚合酶,反应最终体积为100μl。
(6)加入50μl矿物油,离心10s。
(7)置70℃保温5min。
(8)PCR扩增25个循环,95℃1
min,55℃1min,70℃ 1min,最后于70℃延伸10min。
PCR检测出现假阴性的原因有：标本中的HIV-DNA量极少，未能有效地扩增或扩增产物达不到检测水平；DNA模板和PCR产物未能完全变性，使得引物不能或较少与DNA片段结合，从而降低了最终产物的产量。如果临床标本中的HIV基因发生变异，也会出现假阴性。PCR假阳性的原因主要有：标本的交叉污染；重复使用不干净的器具。此外还要合理设置对照，阴性对照用无HIV-DNA标本的反应混合液，阳性对照用已知的HIV-DNA。
四、扩增产物的检测和分析
扩增产物的检测和分析可采用凝胶电泳，限制性内切酶图谱，DNA序列分析及分子杂交等技术。
（一）凝胶电泳分析
根据所采用的引物对之间DNA片段的长度，预计PCR产物的分子大小。通过与凝胶电泳后的DNA片段相比较，可初步判断PCR产物的特异性，然后将产物用限制性内切酶水解，进一步确定扩增产物的特异性。
（二）分子杂交分析
分子杂交既是检测PCR产物特异性的一种较好的方法，也是检测扩增产物的非限制性内切酶位点上碱基突变的有效方法。分子杂交法是根据标记探针与两条引物链之间特异DNA片段的互补性进行的。结果阳性说明PCR产物是特异性的。可利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针与PCR产物进行分子杂交，检测PCR产物的碱基突变。现将检测HIV-DNA的PCR扩增产物常用的几种分子杂交技术分别介绍如下：
PCR扩增技术和分子杂交的敏感性。
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