聚合酶链反应在幽门螺杆菌感染中的新进展

　　发现幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）至今已有十多年，在这十多年期间对Hp的研究进展飞速，已从细胞水平逐渐深入到分子水平。现在认为Hp是胃炎，消化性溃疡的主要致病因素，而且与胃癌有密切关系。Hp本身的螺形，鞭毛结构及其分泌的细菌毒素，空泡毒素，尿素酶，粘蛋白酶，过氧化氢酶，磷脂酶，热休克蛋白，低分子趋化性蛋白质粘附素等都与其致病相关。诊断Hp感染已从传统的细菌学，免疫学手段发展到分子生物学方法，尤其是通过分析Hp核酸，已清楚Hp的部分核苷酸序列，这为聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）用于Hp研究创造了条件。本文就近年有关PCR在Hp研究中的应用作一综述。

　　1　PCR原理

　　PCR是近年发展起来的一种体外扩增特DNA片段的技术，有关它的原理许多文献已有详细介绍，这里只作简述PCR的每次扩增循环包括三步，第1步为变性，在高温下把双链靶DNA拆开；第2步，在较低的温度下使引物与靶DNA互补；第3步在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长，典型的PCR包括30～50循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增，在PCR操作中，有几点必须考虑。①选择引物长度以15～30个碱基为宜，太短特异性不佳，太长不增加特异性而合成费用增加。②引物中应尽量避免单高重复的核苷酸结构，同时还要考虑引物本身的物理特性，避免经物自身退火。③反应的退火温度慎重选择，温度高可提高特异性，但敏感性隆低，温度低则反之。

　　2　引物选择

　　2.1　尿素酶基因核苷酸

　　Hp分泌大量的尿素酶，该酶是导致哺乳动物对Hp产生免疫应答的重要抗原，可能是Hp的重要致病因子之一，因此许多学者采用尿素酶核苷酸序列中的部分片段作为引物。Clayton等报告了Hp尿素酶基因（ureA和tureB）的核苷酸序列，筛选到ureA和tureB两个亚单位，并测得了它们的核苷酸序列。目前有代表性的采用以尿素酶部分核苷酸顺序为引物对的有：Clayton采用一对18个碱基的寡核苷酸链为引物，特异引导扩增后的DNA产物为411个碱基对。其他学者都是以Clayton报告的Hp尿素酶基因的部分核苷酸序列为依据而设计PCR的引物。Courcoux等选择尿一纱酶C基因中的一段294bp作PCR反应。

　　2.2　16S rRNA核苷酸顺序

　　所有细菌的rRNAs根据其大小分为三种：含120个核苷酸的5s rRNA；含1600个核苷酸的16S rRNA及含3000个核苷酸的23S rRNA。分析细菌16s rRNA现已作为细菌分类的一个指标。大量研究证明，Hp的部分16s rRNA与弯曲菌属细菌显著不同，目前采用以16S rRNA部分核苷酸顺序为引物的主要有Ho等，采用一对20个碱基的寡核苷酸链为引物，特异引导扩增后的DNA产物为109个碱基对。有些学者用PCR拉增Hp及与其相类似微生物的16s rRNA，以此来识别H.pylori，H.mustelac和 H.canis。

　　2.3　编码Hp特6kD蛋白质的核苷酸

　　O'Toole等报告Hp提取物中大量的26000蛋白质，作者提出此蛋白质是Hp特异蛋白质，并分析编码该蛋白质核苷酸序列。Hammar等以此为依据，设计一对23个碱基的寡核苷酸链为引物，特异引导拉增后的DNA产物为298个碱基对。

　　2.4　其它

　　Valentine等从基因库中选出1.9kd的DNA片段作为探针，与19株Hp反应都为阳性，与32种306株其它细菌均无反应，其特异性为98.7％，假阳性是由于载体污染。由此作者从1.9kdDNA中的已知288个碱基片段中选出一对20个寡核苷酸链为引物，其特异引导扩增后DNA产物为203个碱基对。

　　纵观不同学者选出的引物，这些引物都能特异地以Hp的DNA为模板，扩增Hp的部分核苷酸，而不引导扩增其它细菌的核苷酸。

　　3　应用

　　3.1　临床诊断

　　自从成功分离出Hp以来，由于Hp感染在临床上的重要性，迫切需要一个快速敏感检测检测标本的方法，学者们在不断探索各种诊断Hp感染的方法。传统的培养方法由于细菌生长要求高，死亡或菌量过少，则常规方法难以检出，其它方法如同位素标记的二氧化碳呼气试验，费用贵，快速尿素酶试验由于制剂标准不统一，消化道其它一些细菌也产生尿素酶，使该方法的特异性受到影响，检测抗Hp抗体方法简易，但很难区分是否为近期感染，随着分子生物学技术不断发展，最近有些实验室采用PCR技术诊断Hp感染，取得满意结果，Ho等采用16s rRNA的部分核苷酸序列为引物，其引物不引导拉增与Hp的16S rRNA十分相近的H.cinaedi，H.mustelac，H.hepaticus和产生琥珀酸沃林氏菌。检测10份已知Hp阳性的病理切片都为阳性，另外4份胃粘膜活检标本符合已知结果并且能检测到不能培养的Hp圆球体的DNA，进一步测试从猪，狒狒和猴胃中分离的细菌，并用内部探针与扩增的DNA产物杂交，提示从这些动物中分离的细菌都为Hp。Engstrand等选用的16s rRNA引物顺序与Ho者不同，作者采用了反向转录PCR技术，先利用反转录酶合成RNA，然后再扩增cDNA。其敏感性比常规PCR提高25～50倍，可检测到2个细菌，检测15份标本，14份标本与呼气试验和培养相同，该方法的特异性为100％，Nguycn等用该方示检测口腔齿斑标本，18例Hp阳性病人中有7例阳性，7例未感染Hp病人中，口齿斑未测到Hp，该结果提示口腔很可能是Hp除胃以外体内另一居留地，这也可能是有些病人抗Hp治疗后复发的原因之一。Clayton等采用urcA基因的部分核苷酸序列为引物，与50株已知Hp反应全部为阳性，与产琥珀酸沃林氏菌，空肠弯曲菌，结肠弯曲菌及螺旋菌属（Helicobacter）中另一产尿素酶的细菌H.mustelae反应都为阴性。作者除了直接检测胃粘膜外还检测了石蜡包埋病理切片，效果较理想。台湾学者设计了重叠PCR。作者选用了两对以尿素酶基因的部分核苷酸序列为引物，当第一对引物的PCR循环结束时，将其拉扩增后的DNA产物再进行第2对引物的PCR循环，其敏感可提高100倍，而无假阳性。作者分析了两例扩增后DNA产物的部分核苷酸序列，在183个碱基对中与已报道的尿素酶基因序列有98％的同源性。Hammar等采用了编码Hp特异蛋白质的部分核苷酸序列为引物，27例胃粘膜标本中，19例PCR阳性，而在所有PCR阳性标本中只有15例培养阳性，另外唾液杯本有9例阳性。Valcntinc等还检测了胃液标本，在13例胃粘膜活检阳性标本中，有11例胃液标本阳性，而采集胃液比采集胃粘膜方便，只需鼻胃管即操作，对那些不易做胃镜的病人和儿童可能是一个比较易被接受的检测方法。Zwet等检测了24例Hp感染病人的粪便标本，12例于胃镜检后进行，另外12例于奥美拉唑治疗2周后进行，24例Hp感染阳性者粪便经PCR检测均未发现有Hp的DNA存在，因此得出结论，在发达国家中，Hp经粪一口途径播的发生率非常低，Levinsteir等也得到同样的结果。

　　3.2　流行病行学研究

　　目前开展周密细致的Hp流行病学研究还有一定的困难，如Hp感染的传播途径，Hp治疗后病人复转阳性是复发还是再感染等等，主要是缺乏准确可靠，方便，易于重复的细菌学分型方法。Hp的生物学分型，血表学分型方法都有报道，但效果不理想。在分子平上，Hp全菌可溶性蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上表明很大的一致性；用核酸内切酶酶切HpDNA的指纹法显示很大的差异性，但是其酶切图谱复杂结果较难解释。PCR作为流行病研究的工具，其敏感性远远超过其他方法，因而有利于确定细菌感染的来源和途径，如检查环境或动物传染源。目前PCR技术用于Hp流行病学研究有：

　　3.2.1　酶切PCR扩增后的DNA产物

　　最早由Langenberg等报告了用Hind Ⅲ限制性内切酶分析Hp全基因的差异，Clayton等用各种核酸内切酶酶不同Hp引物引导扩增后的DNA产物，发现了Sau3A，Hac Ⅲ，MspⅠ和Alu Ⅰ效果较好，17株Hp都有其特异的指纹图。36例抗Hp治疗前后调查结果显示：抗Hp治疗失败是由于细菌持续感染，Foxall用核酸内切酶Hac Ⅲ酶切PCR扩增后的部分尿素酶内切酶基因DNA，22株临床标本有10种图谱，其中2种图谱分别包括5株和6株细菌。Tonodatsu等用Hac Ⅲ酶切PCR扩增后的部分悄素酶β基因，用Southern blot分析98株Hp得出：不同菌株即使经过保藏和多次传代后，其Southern blot图谱仍无改变，因此认为用尿素酶基因作为DNA指纹法的探针可用于Hp感染的流行病学示踪方面。Moorc等用核酸内切酶Hind Ⅲ内切PCR扩增后的部分尿素酶基因DNA，把21株细菌又可分为4组；如用核酸内切酶Alu Ⅰ和Pvu Ⅰ酶切，21株细菌又可分为15组，用核酶内切酶Sau3A内切同组的Hp基因DNA，其酶切图谱截然不同，提示不是相同株，比较抗Hp治疗后细菌酶切图谱，2例病人相同，1例病人不同，表明前者在治疗前后感染两种细菌，用核酸内酶酶切PCR扩增的DNA产物，其图谱比酶切细菌其因DNA图谱简单，易于分析，而且前者可直接采用胃粘膜标本处理，易于操作。

　　3.2.2　RAPD和RFLP

　　RAPD技术是九十年代初由Wilions等最早报道的，RAPD是random amplificd polymorphicDNA的英文字母缩写，也有文献称之为AP（Arbi-trary primer）—PCR。它的原理是采用随机选出的单一核苷酸链为引物，以靶DNA为模板，在多个部位引旨扩增DNA。PAPD结果为细菌株的特异性，故用此主法可区别同种细菌的不同株。Akopyanz等报道用RAPD分析Hp以选择较短（小于10个碱基对）的寡核苷酸链为引物为佳，一般不超过11个碱基对，并且引种的G＋C百分含量必须大于60％，而小于50％效果不甚理想，作者用RAPD技术分析了同一医院中分离到的60株Hp，每株细菌的DNA图谱有很大的差异，追踪调查3例治疗病人，其治疗前后RAPD图谱完全相同。

　　RFLP是restriction fragment length polymorphism的英文缩写，它的原理是设计一对（数对）适当的引物，使扩增片段包含某一个或数个多态性的限制性内切酶识别序列。PCR后，用该限制酶酶切PCR产物，根据电泳后酶切片段长度的变化，即可做出诊断。Owen，Fujimoto等用以PCR为基础的RFLP比较了尿至少酶基因与rRNA基因图谱的差别，提示从尿素酶基因图谱可知：众多Hp培养物是包含有多种基因亚型的Hp混合物，因此得出结论，尿素酶基因图谱完全根除所引起的可靠手段。Nancy等也报道了用RELP从一个病人体内检测出不止一种Hp菌株。

　　3.3　Hp分子遗传学研究

　　PCR还可用于细菌的基因分离，克隆，致病因子基因的序列分析等方面的研究。Courcoax等选择尿素酶C基因中的一段294bp对38例患者标本标进行PCR，扩增产物分别测序，结果所有标本在基因水平上均呈现出多态性，无一例核苷酸序列完全相同的标本，88％的标本，其DNA水平上的改变没有影响相应的氨基酸序列。认为此方法的推广应用或许能够弄清抗Hp治疗4周后再次出现的Hp究竟是复发（recrudescence）还是再次感染（reinfection）这个问题，并可用于了解Hp的传播途径。

　　综上所述，随着分子技术的不断发展，PCR技术在Hp研究中有很大的前途，它具有高效，特异，敏感，快速，简便等优点，标本运输条件不高，甚至可以邮寄，并可作为Hp流行病学研究的一种工具，但是PCR的高敏感性也可能是它潜在的一个致命弱点，极少Hp的DNA污染，PCR过度扩增都可导致假阳性，因此合理选择DNA扩增循环次数，实验室布局合理，操作小心谨慎，不污染样品有仔细设置对照等都是不可忽视的因素，通过这些步聚可以尽可能地克服PCR潜在的缺点，推动Hp的研究进一步深入到分子水平。

刘岱青　陆德源　张振华