幽门螺杆菌生物学性状的研究

　　慢性胃病（B型胃炎、胃溃疡等）及十二指肠球部溃疡等一类常见病、多发病，长期以来，其病因尚未阐明。1983年澳大利亚学者Warren和Marshall从慢性活动性胃炎病人胃粘膜活检标本中发现并分离出幽门螺杆菌（Helicobacter pylori Hp）后，引起了全世界消化病学与有关基础科学的普遍关注。几年来，各国对Hp的研究迅猛发展，其中主要为临床实用性研究，有关Hp生物学特征相对较少，至于Hp具体致病机理则更少。

　　我们是从1985年开始与上海市消化疾病研究所合作开展这方面研究工作的，我们开初的工作（1985～1986）主要有：①在国内最早分离培养成功了Hp；②对上海地区各种慢性胃病中的Hp检出率作了调查；③用双盲法探讨痢特灵、灭滴灵治疗Hp阳性慢性胃炎的疗效，并验证Hp感染与慢性胃病人发病关系。上述研究结果表明：①我国Hp感染率与各种慢性胃病的关系和文献报道的同样广泛和密切；②根据Hp的检出率与各种慢性胃病的高度相关性、Hp感染者经适当药物治疗后与临床症状缓解，以及病理表现改善的密切程度，支持慢性胃病的Hp感染学说。1988年，我们又用Hp超声粉碎的抗原以ELISA法测定了Hp感染的慢性胃炎及消化性溃疡病人、健康体检者和新生儿血清中的抗Hp-IgG抗体，结果表明：①B型胃炎及消化性溃疡病人的阳性率明显高于A型胃炎及健康体检组；②体检组中抗Hp-IgG阳性率随着年龄组的增长而升高，30岁～50岁组达最高峰，70岁以上又稍有下降，③新生儿组抗Hp-IgG阳性率反比1/2岁～10岁年龄组为高，接近成人水平。其抗体可能通过胎盘来自母体中，提示Hp是后天获得感染。上述人群中，抗Hp-IgG抗体水平调查的结果又增强了慢性胃病的Hp感染之说。

　　1987年我们微生物学教研室以“弯曲菌样细菌(Campylobacter-like organisms,CLOS)的生物学地位及致病物质的研究”课题名称申请得到国家自然科学基金的资助。由此对Hp的生物学性状作了比较全面系统的研究，企图对Hp的生物学地位及致病机理作一些探讨。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　①标本1985年5月～1989年10月分别取自上海市仁济医院、纺二医院、新华医院有上消化道主述病人的内窥镜检查标本。②菌种Hp均分自病人。除药敏试验和与空肠弯曲菌的交叉反应者外，都以88065，88073，88082，88109，88152五个菌株作为代表进行试验研究。

　　参考菌种：空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni,CJ）CJ-3276株和结肠弯曲菌F（Campylobacter coli,CC）CC-3278株由法国Borbeaux儿童医院Megraud 博士惠赠，空肠弯曲菌CJ-S131由苏州医学院微生物学教研室提供。胎儿弯曲菌（Campylobacter fetus,CF）日本大阪大学微生物学研究所三轮谷俊夫教授惠赠。

　　1.2 方法

　　1.2.1 光学显微镜检查 取胃粘膜活检标本或菌种培养物在洁净玻片上涂薄膜。自然干燥，加热固定，革兰染色后油镜检查。另取胃粘膜活检标本作石蜡包埋切片，四苯胺兰（touidine blue）染色镜检。

　　1.2.2 分离培养 空肠弯曲菌选择性基础琼脂（上海市卫生防疫站生产）中补充以10%羊血和1%可溶性淀粉，并每1000ml培养基中加入1ml万古霉素（10mg/ml），1mlTMP(5 mg/ml)和1mloctidione(5 mg/ml)制成平板后，置Queue三气培养箱（美国产），气体调节至5%O2，85%N2和10%CO2，37°C培养3d后观察。

　　1.2.3 生化鉴定 主要参考 Cliodna等方法：①氧化酶反应 用竹签挑取血平板上可疑菌落至已被1%盐酸二甲基对苯二胺（E.Mer-ck,Darmstadt产品）溶液浸透、并预先干燥过的滤纸上，10s内出现深紫红色为阳性。②触酶反应 用含3%H2O2液的毛细玻管碰触血平板上菌落，有气泡升起为阳性。③尿素酶反应 将含有菌落棉拭插入尿素肉汤中，30s内棉拭呈粉红色为阳性。④DNA酶试验 在含有甲葳胺兰核酸琼脂的平皿上打孔后，将细菌悬液加于孔中，37°C培养2h后观察结果。小孔周围出现透明小圈者为阳性。⑤碱性磷酸酶反应 用0.02mol/LpH8.0Tris-HCL洗下细菌菌落。加入0.5ml1%磷酸对硝基苯脂（Beckman产品），37°C水浴1 h ,观察结果。呈黄色者为阳性。⑥亮氨酰胺肽酶反应 取小试管2只，1只测定管加待测菌液（约3×1010cfu/ml）0.05ml，另1只空白对照管加H2O0.05ml。然后各加0.2M磷酸缓冲液（pH7.2）0.45ml和基质液（亮氨酰-β-萘胺盐酸20mg溶于H2O25ml，加入0.2mol/LpH7.2的磷酸缓冲液25ml，充分混匀）0.5ml。37°C水浴30min后各加入40%三氯醋酸0.2ml。充分混匀后4000r/min离心沉淀10min。从测定管和空白对照管中各取上清液0.5ml分别装入另2只试管中，并分别加2NHCI0.5ml和0.2%NaNO20.5ml。充分混匀，室温（20°C）中静置10min。再各加0.5%氨基磺酸胺10ml。混匀后，室温（20°C）静置10min 。最后各加N-萘乙烯二胺二盐酸盐溶液[称取N-（1-萘）乙烯二胺二盐酸（分析纯，瑞士，Lichtemptindicht生产）100mg，溶于95%乙醇200ml中，冰箱保存可稳定1个月。临用时，以95%乙醇稀释10位后使用] 2.0ml。20min后观察结果。呈紫色为阳性。⑦马尿酸盐水解试验 接种1环48hCJ/CC培养物或72hHp培养物于0.4ml含1%马 尿酸盐水溶液的小试管中，混匀，放置37°C水浴2h，再轻轻倒入0.2ml茚三酮试剂（3.5g茚三酮溶于100ml丙酮:丁醇=1:溶液）于各管。置37°C水浴，经 10min后看结果。深紫色为阳性反应。

　　1.2.4 抗菌药物敏感性试验 用琼脂稀释法测定13种抗菌物（青霉素G、链霉素、庆大霉素、红霉素、先锋霉素V、四环素、痢特灵、灭滴灵、TMP、洁霉素、次硝酸铋、多粘菌素B、万古霉素）对30个（Hp）菌株（Hp菌株号：85025，85084，85114，85117，85120，85143，85187，85485，85507，85508，85524，85553，85558，85560，85562，85568，85596，85595，85621，85623，85625，85629，85634，85639，85643，85647，85648，85660，85663，85677）的最小抑菌浓度（Minimal inhibition Concentration,MIC）。①菌液准备：待测菌株落分别用生理盐水洗下，比浊调整至108fu/ml。②药敏平板制备：分别取200ul不同种类、不同浓度的抗菌药物稀释（抗菌药物的浓度为0.05μg～100μg/ml的对倍稀释液的对倍稀释系列）置于空的无菌平皿（φ9 cm）中。每只平皿加入加热融化的血琼脂10ml，轻轻摇动使培养基与抗菌药物均匀混合。待琼脂凝固后备用。③细菌拉种：用多点接种器（M2T-P）将菌液点种于上述每只药皿平板上。每个平板点种25个菌种。置微需氧环境中培养3d后观察结果。如Hp在某个抗菌药物浓度的培养基上生长，而在前一个大一倍的尝试的培养基上不长，则以此前一个平板中的抗菌药物尝试为该菌的MIC。

　　1.2.5 菌种保存 挑取3～5环分纯的Hp菌种（菌号：88064，88065，88073，88075，88077，88082，88099，88108，88109，88152，88223，85289，85682，85688）于装有灭菌脱脂牛奶的Eppendorf塑料离心管，置-70°C冻存。经1年后复苏鉴定。

　　1.3 超微结构的研究

　　以Hp88065，88073，88082，88109，88152菌株及CJ-3276，CJ-131、CC3278参考菌株制成负染和超薄切片，置H-500透射电镜下观察。取新鲜采集的胃粘膜活检标本经固定后在临界点下干燥，真空涂金。在JEOL JSM0S40扫描电镜下观察。

　　1.4 Hp的DNA G+Cmol%与菌体脂肪酸组成测定

　　1.4.1 细菌DNA中G+Cmol%含量的测定 主要参赞丁鉴等高压液相色谱测定。①Hp DNA的提取；将细菌悬液经4000e/min×15离心沉淀，用0.15mol/LnaCI-0.1M EDTA pH8.0 溶液（SE液）洗一次后，重悬浮于10mlSE液中。加溶菌酶，使终浓度为2％的SDS，放60°C水浴15min。用等体积酚／氯仿·异戊醇（体积之比为3/1）抽提二次后，再用等体积氯仿/异戊醇（体积之比为24/1）和等体积乙醚各抽提一次。水相在pH7.8,10mmol/L Tris-HCI,1mmol/L ED-TA中透析4°C过夜。透析后的抽提液中加入经100°C、15min处理的Rnase，使终尝试为200ug/ml，37°C,2h。加蛋白酶K，终尝试为200ug/ml，37°C轻摇2h。用等体积酚/氯仿（体积之比为1/1）和等体积氯仿·异戊醇各抽提一次。水相加NaCl和0.1M，溶解后，加入2倍体积的冷无水乙醇。混匀后，①-20°C，13000g×30min，得DNA沉淀。②游离碱基的制备：在DNA沉淀物中加入100μl72%高氯酸，使完全溶解后，移入安瓿中，熔封管口。100°C水解1h，放入4°C冰箱待用。③高压液相色谱测定：用Shimadzu LC-4A高压液相色谱义；柱为不锈钢制，4.6mm×250mm；填充材料为Nucleosil C18,5um。流动相为0.1mol/L pH3.9甲酸钠，流速0.8ml/min。压力120kg/cm2,柱温40°C检测器为UV254nm,0.02AuFs。④标准溶液的配制：用电子称（Sartorius research）分别准确称取腺嘌呤（A，,英国BDH产品），嘌呤（G，Sigma产品），胞嘧啶（C，中科院生化所产品）和胸腺嘧啶（T，上海市化学试剂公司产品）。加数滴磷酸，以高压液相色谱仪标定出峰位置。⑤碱基物相对克分子样正因子的测定和G+Cmcl1%的计算：

表1 四种碱基的分子量、毫克/分子浓度及相对克分子较正因子

　　a..相对克分子校正因子（f′m）的测定标准A，T，G，C混合溶液，在上述色谱条件下进样，测定每个峰面积。按下式计算A、T、G、C的相对克分子样正因子（fm）。

　　式中A峰为面积，m为进样量，M为分子量，下标S为内标物（本实验以A为内标物），i待测碱基。

　　b.G+Cmol%计算：10μl各样测样品进样后，测出峰面积，乘上相对克分子校正因子（f′m），然后归一化，用下式

　　计算，求得其分子百分数。

　　1.4.2 细菌菌体脂肪酸组成分析 主要参考I toh等方法①标准品的处理 在脂肪酸标准品(Sigma产品，EC10A偶炭链脂肪酸，OC-9奇炭链脂肪酸，UN-10不饱和脂肪酸)中加入4ml25%盐酸-甲醇后，再加入1ml NaCl溶液。用4ml已烷：乙醚=1:1（体积比）溶液萃取3次。有机相用N2吹干，最后用0.5ml已烷定量。取1μl作色谱分析，标定各峰位置。②样品的处理：在干重为10mg～20mg的细菌中加入生理盐水1ml，混均后转入磨口玻璃管中。加入含15%NaOH的水-甲醇（体积比为1:1）溶液2～4ml后，在100°C水浴中加热30min。稍冷后，加入6NHCl,使溶液pH达2.0。加入25%HCl-CH3OH溶液5ml，100°C水浴加热15min。冷却后，用N2吹干HCl至原体积的一半。加入1ml饱和NaCl溶液。用12ml1:1的乙醚-已烷溶液分三次萃取，萃取后的有机溶液放入有塞磨口离心管中。70°C水浴蒸发溶液至1ml左右。用N2吹至0.5ml左右，加入少量Na2SO4去除残余水分。4000r/min离心15min后，取上层有机相，加入1ml已烷溶解。取1μl作色谱分析。③气相色谱测定条件：色谱仪为日本岛津公司的GC-9A，色谱柱为2%的OV-101，80～100目，Chromosorb AW，W，DMCS。操作条件：柱温180°C～230°C，程序升温，升温速率4°C/min，进器温度和检测器（FIS）温度为260°C，RANGE=102。氮气压力为0.4kg/cm2，速度为30ml/min，空气压力为0.3kg/cm2。

　　1.5 Hp菌体蛋白电泳与与CJ间抗原交叉反应

　　1.5.1 Hp菌体蛋白电脉 ①样品的准备:将细菌菌苔用生理盐水洗下.在超声粉碎仪上粉碎(dute cycle 50%,time 6min。Output Control 8,pulse)。然后10000r/min离心10min，4°C。上清蛋白定量。用0.01ml/LpH7.2磷酸缓冲液稀释至2mg/ml，-20°C保存。②SDS-PAGE：主要参考Blaser的方法。用pH8.3 Tris-甘氨酸作电泳缓冲液：分离胶浓度为10%；每份样品加20μl；以低分子量标准蛋白（MV17500～94000，中科院上海生化所东风试剂厂产品）作标准蛋白；在10mA恒流下电泳；考马斯兰G～250染色。

　　1.5.2 用Hp耐热抗原致敏的红细胞与CJ的Penner分型血清作间接血凝，测定Hp与CJ之间的交叉反应。①CJ Penner分型血清的准备：CJ的Penner分型血清（由卫生部药品生物制品检验所、上海卫生防疫站及苏州医学院微生物教研室联合研制）由苏州医学院微生物学教研室提供。先将25个免疫血清分别根据特异性较强或交叉反应较多的血清组合在同一多价血清内。共分6组（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ），Penner5，29，45，52型不包括在多价血清内，每种血清使用时效价稀释成1:1280二种浓度备用。②Hp耐热抗原致敏的红细胞的制备a.Hp耐热抗原制备：将血平板上洗下的28种Hp菌株（菌号：85135A，85158，85130，85132，85155，85138，85084，85067，85031，85070，85093，85120，85157，85071，85123，85141，85113，85134，85070，85117，85142，85134B，85085，85114，85118，85030，85111，85117）的菌液，均调整至9×109／ml浓度，100°C加热1h，3000r/min离心沉淀20min。取上清备用。B.羊红细胞制备：取新鲜脱纤维蛋白羊血，离心沉淀，弃上清用pH7.0磷酸缓冲液洗3次后，3000r/min离心沉淀10min，弃上清。用PBS配成1%红细胞悬液。C.致敏：分别将28种1ml的耐热抗析与等量1%羊红细胞悬液混合均匀置37°C水浴1h。3000r/min离心10min。弃上清。用PBS洗三次，最后配成0.5%致敏红细胞悬液。③交叉凝集反应：用96孔U型塑料板，纵向分别加入Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ组多价血清及5，29，45，52型的单价血清。横向单行为1:640浓度的血清0.25μl，双行为1:1280浓度的血清0.25μl。如此准备好8块已添加CJ分型血清的96孔塑料板。然后在每两行为一组的CJ分型血清中加入一种Hp耐热抗原致敏的红细胞悬液，每孔0.25μl。待28种Hp耐热抗原致敏的红细胞悬液均加妥后，将96孔塑料板均置微型振荡器上振荡1min～2min ,使充分混匀。置37°C孵育2h后观察结果。根据凝集程度，以++++、+++、++、+、± -符号记录结果。以血清最高稀释度呈现“++”以上程度凝集者为阳性。如上交叉凝集反应中先以多份血清进行粗筛，若效价超过1:1000者，再以单价血清进行分型，效价≥1:1280者作为阳性。

　　2 结果

　　2.1 Hp的基本生物学性状

　　2.1.1 光镜下形态结构 Hp为“S”形、“U”形或弧形杆菌。菌体宽0.3～0.5μm,长1.5～5.0μm。大多大小均匀，形态典型，革兰染色阴性。Hp较CJ/CC稍粗，两端钝圆。在陈旧培养物中，Hp常变成圆球体，在革兰染色下呈现大小不一、染色深浅不均，周围界较模糊的特征。在胃粘膜活检标本直接涂片中，多数存在于着色较浅的粘液带中，常呈鱼贯状排列，在Hp密集处，甚少杂菌混杂，在着色的组织液背镜下，Hp菌全周围常呈现有微荚膜样结构。在病理组织切片中可见，Hp多数存在胃粘膜上皮细胞表面，特别是在胃小凹。在病理切片中尚可见到在胃粘膜表面有Hp存在的附近部位常有大量中性粒细胞、浆细胞等炎症细胞的浸润。在胃的肠腺化生区域很难找到Hp，但是在十二指肠的胃化生区域却能找到Hp。

　　2.1.2 菌落特征及细菌动力 在微需氧条件下，经37°C72h培养，Hp形成较小菌落，直径＜1mm，呈灰白或灰色，边缘整齐，隆起的圆形菌落。打开平皿有一股特异的气味。新鲜的菌落制成湿片在暗视野下可见Hp呈螺旋状迅速向前的运动。亦可见翻滚运动。

　　2.1.3 生化反应特征 Hp的生化反应特征见表2。Hp均有氧化酶、触酶、尿素酶、DNA酶、碱性磷酸酶和亮氨酰酞酶，而马尿酸盐试验均阴性，CJ和CC仅有氧化酶和触酶，而CJ-S131能分解马尿酸盐。

　　2.1.4 Hp对抗生素的敏感性 25株Hp对13种抗菌药物的药敏性见表3。

表2 Hp、CJ和CC生化反应

表3 25株Hp对13种抗菌药物的药敏结果

　　从表中可知所有被检的Hp菌株对红霉素、链霉素、四环素、庆大霉素、青霉素G及痢特灵敏感，其中特别是四环素、青霉素G和痢特灵的敏感性尤甚，MIC90分别是0.2,0.1及0.2。MIC50均＜ 0.05。Hp对TMP、多粘菌素B、万古菌素及灭滴灵耐药，大部分菌株的MIC均＞100。

　　2.1.5 菌种保存 15株Hp菌株，经-70°C冰箱保存一年后复苏，14株存活，对存活的14株作直接涂片革兰染色，油镜检查，其中的13株形态不变，1株成圆球体。我们又对这13株进行了氧化酶、触酶、尿素酶、DNA酶、碱性磷酸酶试验，13株Hp阳性，这与保存前相同。

　　2.2 Hp的超微结构 从不同病人胃粘膜上分离得Hp的形态结构基本一致,呈”S”形弯曲、弧形或稍直，偶见分枝状。一般表面较光滑，一端或二端（多数为一端）具有2～6条带鞘鞭毛，长度稍长于菌体。带鞘的鞭毛直径在30mm左右。每一鞭毛基部与菌体细胞膜上直径约50mm的圆球状结构相连。菌体末端鞭毛基础结构内侧，有一宽达200mm～400mm的电子密度明显降低区域，其基底部无明显的细胞膜结构界限。在Hp负染标本中，部分菌株在菌体周围可见大小均一、排列整齐的上百个“指”状突起，似直接为外膜的组成部分，与菌体内部结构无明显直接关系。在参考菌株中，CJ与CC末端呈圆锥体样，稍尖，顶端明显地呈吸盘样结构。CJ与CC均有单根无鞘端鞭毛从顶端的吸盘样凹陷的中心伸出。鞭毛根部均未见电子密度明显降低区域。

　　在胃粘膜活检标本的超薄片中可见：一般情况下，胃粘膜上皮与粘液层间不存在细菌。若出现细菌，常为大小、形态较统一的、都呈弯曲样特征的菌群。多聚居在胃小凹中或上皮细胞与上皮细胞连接处，亦常常镶嵌在微绒毛之间。偶见Hp在局部的胃粘膜上皮上定位似有明显的方向性。Hp与粘膜上皮的粘附方式有三种：Hp通过鞭毛顶端直接插入或粘附在胃粘膜上皮细胞表面；Hp菌体怀胃上皮细胞间保持一定的间距，借无数的细丝状菌毛样网状结构使两者互相粘附；Hp菌体的部分细胞壁与胃上皮细胞的细胞膜直接相贴粘附，二者间几无间距。最多见的是第二形式，有时同一细菌可同时出现两种或以上粘附形式。Hp粘附聚居外的上皮细胞除微绒毛明显减少或消失外，多数情况下很少发现有明显的细胞病理学变化。胃粘膜上皮表面有Hp粘附的邻近区域，往往有炎性细胞的浸润和渗出。胃粘膜上皮细胞中尚可偶见对Hp的吞噬现象。

　　2.3 Hp的DNA+Cmol%和菌体脂肪酸组成

　　2.3.1 Hp的DNA G+C MOL%含量测得的Hp、CJ/CC DNA G+C mol%含量见表4

表4 Hp CJ/CC DNA G+C mol%含量

　　2.3.2 Hp ,CJ/CC菌体脂肪酸的组成 Hp 的脂肪酸组成主要是十九碳环丙烷酸(19:0cyc)、十八碳酸（18:0）、十八碳烯酸（18:1）和十四碳酸（14:0），CJ/CC的脂肪酸组成主要是十六碳酸（16:0）、十六碳烯酸（16:1）和十八碳烯酸（18:1，表5）。

表5 Hp,CJ/CC菌体脂肪酸组成

　　2.4 Hp菌体蛋白电泳与CJ分型血清间的交叉反应

　　2.4.1 CP菌体蛋白SDS-PAGE Hp的主要条带Mr约为25100，28200，44700，62000，70800，81900，12600七条。CJ/CC条带相似，其主要条带Mr约为63000，89100和100000。

　　2.4.2 CP与CJ抗原交叉反应 可见除CJ-22502免疫获得的Penner45型血清与绝大部分Hp菌株（28株中的19株）及PennerV组多价血清与Hp-85607有较强的交叉反应外，其余几乎无免疫学上的交叉（表6）。Hp-85067与V组多价血清的因子血清的反应结果见表7。

表7 Hp-85067与V组因子血清间的抗原抗体交叉反

　　3 讨论

　　3.1 Hp的生物学地位 虽然Hp引起的世界性关注及人们对其广泛研究是在1983年以后，但早在1847年 Bottcher已在人胃中发现了螺形的细菌，随后人们又从许多动物-狗、大鼠、猫的胃中发现类似细菌。1906年又从溃疡性胃癌病人的胃内容物中找到这类细菌。其他一些报告证实在健康人中不易发现它们。1939年 Doenges在242例人胃尸检的染色标本中发现有43%存在数种不同类型的螺形菌，但不明确这些菌与各种胃病间的相互关系。1954年Palmer在1000例胃活检标本中未能证实上述报告，认为前人发现地螺形菌系吞入或死后污染所致。1975年Steer和Colin-Jones报告了胃溃疡病人胃粘膜上出现细菌，经分离培养，结果是绿脓杆菌。后人仔细观察该文图片，认为胃粘膜上的细菌是一种与绿脓杆菌无关的螺形菌。在同一时期，许多学者发现多种动物胃中存在有内源性尿素酶活性。最早是1924年有Luck和Seth描述的，后在1955年Korngerg和Davies的综述中断定胃的尿素酶主要存在于胃体部，且是细菌源性的。在人类胃的研究中证实了这种酶的存在与溃疡病之间的关系，有些病人还成功地利用了尿素进行了治疗。

　　1983年Warren从慢性活动性胃炎活检标本的胃粘膜上皮表面发现了一种未经鉴定的弯曲状细菌，Marshall又用弯曲菌属的分离培养技术从幽门的活检标本中分离培养成功了该菌。由此，曾先后命名为GCLOs和Hp。1984年Langenberg并发现原先认为的胃中内源性尿素酶即由此菌产生。因此在1984年以前人们对Hp的生物学性状了解得比较少，只知它在光镜下呈螺形，分离培养需微氧条件，与弯曲菌属的代表菌种-空肠弯曲菌相似，只是它有较强的尿素酶活性与空肠弯曲菌不同。此后这种细菌与各种慢性胃病间的密切相关性为世界各地的学者所进一步证实。由此掀起了一股对Hp研究的热潮。

　　在国内，我们对Hp表型特征—生物学性状的系统研究是比较早的，其结果已如前述。根据这些结果，Hp确实与弯曲菌属的代表菌种——CJ有一些共同或相近之处，例如光镜下的形态相似，都需要微氧的条件分离培养，营养要求大致接近。培养的最适温度虽有差别，但都能在37°C生长，都能产生触酶、氧化酶，均不能利用糖类，能产生微量的H2S。对各种抗生素的敏感谱与CJ相比，绝对值虽有一些出入，但总趋势大致相仿。Hp的DNAG+Cmol%与CJ基本相同，甚至重叠在同一范围内。从这些特征，Hp与CJ同归一属似乎无可置疑。

　　俟后，进一步的研究发现Hp与CJ间存在着更多的本质上差别：①有一些重要的生化反应与CJ明显不同，例如尿素DNA酶，碱性磷酸酶、亮氨酰胺酞酶等，Hp均为阳性，而CJ/CC均为阴性，这与国外文献报道是一致的。②更重要的是在超微结构上Hp与CJ/CC存在着不同，特别是鞭毛、鞭毛的根部和菌体末端的外形其内侧具有“极膜”，曾提出它可能与水螺菌（Aquaspirillum，AS）同属。但不久发现AS为双极丛毛菌，一般每端只有1～2根鞭毛，Hp虽偶也可见双极鞭毛，但多数情况下只有一端有鞭毛，且为有鞘鞭毛，数量多到6根。更重要的原因是因为AS的DNA G+Cmol%为49～66，与Hp相关甚大。很快就不再有人提及。③从所测的Hp菌体脂肪酸组成来看，Hp与CJ/CC之间亦存在着明显差别，它们的主峰是各不相同的，这一特征与国外文献报道基本一致，只是我们Hp的几个主峰间的相对值与国外报道者略有上下，推测可能是地方菌株之间的差异。④按菌体蛋白电泳的主要蛋白条带，Hp与弯曲菌属的主要代表菌种之间亦存在明显的不同，Hp有7条主要条带，CJ/CC仅有3条，其中只有分子量为63000与89100的2个条带基本相同。⑤根据Hp耐热抗原与CJ的Penner分型血清的交叉反应，它们之间亦不存在有明显的交叉抗原，其中有一个值得讨论的问题是由CJ22052菌株免疫得的Penner45型血清与28株Hp菌之间有18株发生明显交叉反应。我们深感这一现象奇特，特地对22052菌株作了深入一步的研究，发现它在基本生物学性状方面确实与CJ类似，但在电镜下其菌体末端及鞭毛的特征与C明所不同。更重要的是DNA G+Cmol%仅有27.8，明显地超越弯曲菌属范围。因此，若22052菌株不属于弯曲菌属，则Hp与CJ之间基本上不存在耐热抗原的交叉。至于Hp85067菌株与的Penner26，34，35型血清之间的交叉凝集原因未明，有待进一步作出解释。

表8 Hp与CJ/CC.CF菌体末端扩鞭毛的超微结构比较

　　*国外文献中亦有同样报道，其他特征尚未见文献报道。

　　综上所述，从Hp的各方面的表型特征来看，Hp与弯曲菌属的代表菌各：CJ22052菌株菌体末端超微结构（×60000）－CJ、CC之间，差异性多于共同性，且其差异点比共同点更具有本质性。因此，我们赞同国外个别学者提出的Hp不归入弯曲菌属，而宜另立一个新属的主张。

　　至于Hp究竟应归入哪属细菌，Romaniuk从分析Hp，多种弯曲菌属细菌和产琥珀酸沃林菌(Wolinella succinogenes,WS)等的16s rRNA核苷酸序列得出结论，认为Hp与弯曲菌属关系较远，而与WS关系较近，似乎应与WS同归一属。但Hudson则认为Hp在DNAG+Vmol%(36%～38%对 46%～49%)，脂肪酸组成，极性脂质（polar lipid），总蛋白电泳谱和它同时具有MK-6及TPQ-6方面与WS不同，因此不宜归入沃林氏属，他认为根据Hp的培养和形态的基本特征仍应归入弯曲菌属为宜。遗憾的是迄今还没有一个比较统一的能够应用于所有细菌的细菌学命名原则，因此对有一些难于命名的细菌免不了会引起一些争论。虽然现在对有一些细菌的研究已经开始迈入了分子遗传学的领域，但是当前以表现型特征作为分类的主要依据仍然无可置辩地具有更现实的意义。虽然几乎收集了当今世界上弯曲菌属所有的15种菌种，甚至包括Hp和WS，进行了16s r RNA核苷酸顺序的分析 。根据同源性的程度不同将它们分成三群，可是他不得不承认由于缺少对弯曲菌属各种菌种表现型特征的全面了解和也由于没有将所有的细菌都用同样的试验和同样的方法比较过，因此难于对三群细菌作出适当的专门的描述。Good-win认为由于Hp在临床上的重要性，急需把它命名学地位及早地确定下来，他对Hp、WS和弯曲菌属细菌作了超微结构和形态、菌体脂肪酸组成、甲苯醌、生长特征和酶的活力五个方面的表现型特征作了研究，他的结论是Hp不应归入沃林菌属，他提出给它命名为Helicobacter pylori（暂译为幽门螺杆菌）。我们的意见偏向于赞同他的意见，因为我们亦对一部分细菌作了系统的表现型特征的研究，除了甲苯醌我们没有做以外，我们还做了DNA G+Cmol%，菌体蛋白蛋电泳分析和与CJ的Penner分型血清之间交叉反应的研究，大部分结果都表明，Hp与CJ之间有明显的不同。

　　3.2 Hp的致病性 自从Warren和Marshall发现Hp后，世界各地学者相继从各种慢性胃病及十二指肠溃疡病人的活检标本中找到了Hp，且检出率都很高，从而初步确定了Hp与各种慢性胃病的密切相关性。1985年Marshall按照Koch的病原体致病性原则，吞服了Hp菌液作了自身感染实验。二位学者先后都找到了Hp在自身引起急、慢性胃炎的证据。1987年Krakowka又以悉生小猪(Gnotobiotic piglet)口饲Hp菌液液造成Hp感染的动物模型。至此，Hp直接或间接与各种慢性胃病有关已得到大多数学者的认可。但Hp的致病物质和致病机制，迄今尚未阐明。我们从超微结构研究中发现了一些在国内外文献中尚未作报道的现象，并结合光镜下的观察所见和一些有关文献，对Hp的致病机制或致病过程作出如下推断。

　　胃是人们对摄入的食物彻底消化前进行预处理的重要器官。在预处理过程中，伪造胃壁肌肉收缩和舒张的物理和机械作用使食物在胃中受到胃酸和胃蛋白酶的强烈化学作用而得到初步消化。本来胃的这种强力的缩舒运动及强酸，酶类作用对胃壁本身就可能造成损伤作用，但由于在胃壁粘膜表面有一层较厚的、且在不断代谢更新的不溶性粘液连续层存在，且在其表面尚有可溶性粘液层起着滋润作用，因而保护了胃粘膜。为何经口入胃的过路细菌很多，而独有Hp能透过不溶性粘液层定居于胃粘膜上皮表面？为何Hp对人胃的感染率这么高，而在不溶性粘液层下胃粘膜上皮表面几乎找不到有第二种细菌的大量存在？为何一个人一旦被Hp感染后，Hp能长期在胃中持续存在？为何用有效抗生素治疗常不能彻底杀灭胃粘膜上的Hp？所有这些问题都说明Hp的感染有其独特性。根据我们所观察到的Hp与胃粘膜之间有关系特别是Hp的三种粘附现象，我们提出Hp感染过程的假说如下。

　　第一步，Hp利用其特征性的菌体和鞭毛结构穿透不溶性粘液层，当Hp随食物进入胃中，首先伪造其鞭毛与胃粘膜表面的不溶性粘液层发生亲和性吸附。在不断运动着的胃壁上初步找到了一个落脚点。然后借其菌体的螺形结构，以及一端有数根象推进器样活泼运动的鞭毛使它在粘稠的不溶性液层中自由泳动。Venables报道，胃粘膜上的不溶性粘液层的化学结构是由二硫键连接的四个同等大小的亚单位组成的多聚体糖蛋白构成的。每一个亚单位以蛋白质为核心，四周围绕有碳水化合物的侧链，形似“瓶刷状”。 Hp利用其菌体及鞭毛结构上的特点可在这种平行排列的“瓶刷状”结构中作螺旋形的向前运动。

　　Hazell曾在模拟的粘稠环境中发现Hp比同样具有鞭毛的大肠杆菌的泳动速度快10倍。这就说明了在食物经过胃的短暂时间内，为何几乎只有Hp能透过不溶性粘液层，而其它细菌很难通过的重要原因。

　　第二，Hp依靠其菌体表面菌毛样网状结构稳定地定居于胃粘膜上皮细胞表面，Hp透过不溶性粘液层后首先仍然通过鞭毛在粘膜上皮表面“抛锚”。然后菌体迅速向粘膜上皮表面靠拢。伪造其菌体表面菌毛样网状结构（或称糖萼Glycocalyx）与胃粘膜上皮细胞表面紧密相连，达到比较稳定地固定在胃粘膜上皮的局部。这Hp特异性地只在胃粘膜组织或肠及食管胃化的组织上定居，而不在其他组织上定居的原因，可能在胃粘膜组织上存在有Hp的特异性受体之故。正由于它存在着特异性的较强的粘附机制，因此尽管不溶性粘液层和胃粘膜上皮以较快的速度不断代谢更新，一部分Hp随着表面的粘膜上皮和不溶性粘液层的更新而脱落，但总还是有一部分Hp在胃的不断运动中在就近的新生的粘膜表面或不溶性粘液层找到继续定居的场所。这就是造成人类的胃粘膜一旦被Hp感染后，Hp就较难以彻底消除的缘故，结果易形成持续感染的状态。这也是人胃的Hp感染率为何这么高的原因。

　　第三步，Hp部分细胞壁与胃粘膜上皮细胞直接相贴，依靠其脂多糖与细胞毒素等引起胃壁的病变，Hp的感染还不等于发病，只有在某种尚待探明的因素影响下，Hp菌体的部分细胞壁与胃粘膜上皮细胞直接相贴的第三种粘附机制过渡后，才由于细胞壁（这时Hp已失去包在菌体外面的一层外膜样结构）脂多糖的内毒素样作用引起局部粘膜样结构）脂多糖的内毒素样作用引起局部粘膜的炎症。另外，粘膜上皮表面大量Hp还可能由于所产生的强有力的尿素酶分解尿素后产生的氨离子阻挡H⁺从胃腺向胃腔通过。胃蛋白酶对粘液素的降解，细胞毒素对细胞的毒性作用等导致粘膜的溃疡。胃炎可能是溃疡的基础，反过来，溃疡又可能促进胃炎，因此慢性胃病中的胃炎和溃疡两种基本类型都与Hp感染的直接或间接作用密切相关。Hp在体外对许多抗生素是敏感的，但是由于种种原因真正能用于胃部疾病治疗的抗生素是有限的，即使有效的抗生素，由于不溶性粘液层的保护作用，亦很难将Hp彻底消灭干净。

张振华

上海第二医科大学微生物学教研室（200025）