第三节　PCR操作范例及反应体系的组成

　　一、PCR操作范例

　　在一个典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg²⁺和两个合成的DNA引物。模板DNa 94℃变性1min，引物与模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3～5min；在末次循环后，样品仍需继续延伸3～5min以上，确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成，加入量和反应条件，使人们以此为基础，对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件，特列举Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA试剂盒提供的典型反应条件供参考。

表22-1 PCR反应混合液

　　扩增条件：94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25～30个循环。

　　注：[1]反应缓冲液[10×]含：100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),

　　15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl₂,

　　0.01%(W/V)明胶（Sigma G2500）

　　[2]酶储存缓冲液（-20℃）含：50%甘油，100mmol/l KCl,

　　20mmol/L Tris-HCl ph8.0

　　0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT

　　200μg/ml明胶

　　0.5%吐温20，0.5% Nonidet P40

　　[3][4]引物，1，2：扩增λ-噬菌体基因中500bp的片段

　　引物1序列：7131～7155（5’）-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)

　　引物2序列：7606～7630（5’）-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)

　　注意（3’）端有2个bp互补故易生成50bp的双体

　　二、PCR反应系统的组成

　　（一）PCR缓冲液（PCr Buffer）

　　用于PCR的标准缓冲液见PCR操作范例。于72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg²⁺优于Mn²⁺，而Ca²⁺无任何作用。

　　1．Mg²⁺浓度Mg²⁺的最佳浓度为1.5mmol/L(当各种dNTP浓度为200mmol/L时)，但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg²⁺浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。Mg²⁺过量易生成非特异性扩增产物，Mg²⁺不足易使产量降低。

　　样品中存在的较高浓度的螯合剂如EDTA或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根，会与Mg²⁺结合而降低Mg²⁺有效浓度。因此，用作模板的DNA应溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。

　　dNTP含有磷酸根，其浓度变化将影响Mg²⁺的有效浓度。标准反应体系中4×dTNPs的总浓度为0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg²⁺浓度。因此，在高浓度DNA及dNTP条件时，必须相应调整Mg²⁺的浓度。

　　2．Tris -HCl缓冲液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl缓冲液，很少使用其他类型的缓冲液。Tris缓冲液是一种双极化的离子缓冲液，pKa为8.3(20℃),△pKa为0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)时，在典型的热循环条件下，真正的pH值在7.8～6.8之间。

　　3．KCl浓度K⁺浓度在50mmol/L 时能促进引物退火。但现在的研究表明，NaCl浓度在50mmol/L时，KCl浓度高于50mmol/L将会抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl对PCR结果没有太大影响。

　　4．明胶明胶和BSA或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为100μg/ml，但现在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR结果，影响不大。

　　5．二甲基亚砜（DMSO）　　在使用Klenow片段进行PCR时DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于减少DNA的二级结构，使（G+C）%含量高的模板易于完全变性，在反应体系中加入DMSO使PCR产物直接测序更易进行，但超过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多数并不使用DMSO。

　　（二）四种脱氧三磷酸核苷酸（4×dNTPs）

　　在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mmol/L会抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。

　　决定最低dNTP浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成，例如，在100μl反应体系中，4×dNTPs浓度若用20μmol/L，基本满足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。

　　购自厂商的dNTP溶液一般均未调pH，应用1mol/l NaOH将dNTP贮存液pH调至7.0，以保证反应的pH值不低于7.1。市购的游离核苷酸冻干粉，溶解后要用NaOH中和，再用紫外分光光度计定量。

　　（三）引物的量

　　引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～1μmol/L之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。

　　（四）Taq DNA聚合酶的量

　　典型PCR反应混合物中，所用酶浓度为2.5U/μl，常用范围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，多聚酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。

　　由于生产厂家所用兵配方、制造条件以及活性定义不同，不同厂商供应的Taq DNA聚合酶性能也有所不同。

　　Cetus公司酶定义是：1个酶单位是指在以下分析条件下，于74℃，30min内使10nmmol的dNTP掺入酸不溶性成分所需的酶。测定时间为10min，折算成30min掺入量。

　　分析条件为25nmol/L TAPS（三羟基-甲基-氨基丙烷磺酸钠pH9.3,25℃）,50mmol/l KCl, 2mmol/L MgCl₂,1mmol/L β-ME（巯基乙醇），dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L，dCTP为100mmol/L(由不标记及α-³²P标记混合)，12.μg变性鲱鱼精子DNA，最终体积50μl。

　　（五）模板

　　单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，还应用ng级的克隆DNA，μg水平的单拷贝染色体DNA或10⁴拷贝的待扩增片段作为起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。

　　DNA的大小并不是关键的因素，但当使用极高分子量的DNA（如基因组的DNA时），如用超声处理或用切点罕见的限制酶（如Sal₁和Not₁）先行消化，则扩增效果更好。闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA，因此，用质粒作反应模板时最好先将其线状化。

　　模板靶序列的浓度因情况而异，往往非实验人员所控制，实验可按已知靶序列量逆减的方式（1ng,0.1ng,0.001ng等），设置一组对照反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。

　　（六）石蜡油

　　PCR扩增时建议在混合物上面铺一层石蜡油，减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。研究表明，应用石蜡油可使扩增产量增加5倍，可能与石蜡油维持热恒定和整个反应体系中盐浓度有关。

　　三、电泳分析

　　在实际工作中常采用琼脂糖凝胶电泳。一般情况下先在电泳缓冲液或凝胶中加1%溴化乙锭（EB）（每100ml加100μl），然后将已经制备好的1%～2%琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配制）放入电泳槽内，加入待测样品10μl，同时用分子量标准品作标记。琼脂糖浓度应按分离DNA片段的大小进行选择，一般用1.5%～2%，电泳电压75V，待样品进行凝胶内距胶末端1cm时，切断电源，取出凝胶在紫外灯下直接观察结果。

　　由于溴化乙锭可与双链DNA形成结合物，在紫外灯下能发射荧光，使EB的荧光强度增强80～100倍，所以，电泳后凝胶在紫外灯下可直接观察。一般肉眼观察DNA量可达10ng，其荧光强度与DNA含量成正比。

　　DNA分子在凝胶中泳动速度决定于电荷效应及分子效应。前者由所带净电荷量决定，而后者与分子大小及构型有关。按照DNA分子大小，其凝胶浓度可做不同的调整。有条件的实验室也可用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析扩增的DNA片段。

表22-2 电泳检测扩增结果，EB荧光显色（254nm）