第三节　放射性同位素标记核酸探针

　　最常用的同位素是α-³²PdNTP,³HdNTP,及³⁵SdNTP，多用缺品平移法、末端标记法，随机引物延伸法和反转录标记法。在以mRNA制备cDNA时，同时掺入标记的脱氧核苷酸，制出cD－NA标记探针。

　　一、缺口平移法

　　在适当的浓度的DNase I作用下在一双链DNA上制造一些缺口，再利用大肠杆菌DNA聚合酶I 的5’—3’外切酶活性依次切除缺口下游的核酸序列，同时将四种脱氧三磷酸核苷（其中一种用放射性标记）利用该酶5’—3’聚合活性补人缺口，使缺口逐个平称并在平移过程中形成标记的新生核酸链。此法也适用于探针的非放射性标记。如³²P标记DNA探针（缺口平移法）：反应体积为25μl，内含0.3μgDNA片段，4μl 0.2μmol/L dNTP, 1.1×10⁶Bq [α-³²P]dATP,1μl2万倍稀释的DNA酶和2μl DNA聚合酶I，6μl缓冲液[为50mmol/l Tris·HCl(PH7.2)、10mmol/l MgSO₄、1mmol/L二硫苏糖醇（DTT）和50μg/ml BSA]，反应在14_℃进行3h。标记DNA经Sephadex (G-50)柱层析回收。

　　二、末端标记法

　　在大肠杆菌T₄噬菌体多聚核苷酸激酶（T₄PNK）的催化下，将γ-³²P-ATP上的磷酸连接到寡核苷酸的5’末端上。要求标记的寡核苷酸5’端必须带羟基。反应式为：

　　此法适用于标记合成的寡核苷酸探针。如将底物改为Bio –11 –dUTP，也可以在3’端标记上一个生物素。

　　寡核苷酸³⁵S的3’—末端标记法：将下列液体依次加入Eppendorf管中。

寡核苷酸（1 pmol）1μl

10×Tailing buffer 2μl

　　[α-³⁵S]2μl

　　双蒸馏水14μl

　　末端脱氧核苷酸酶1μl（10Unit）

　　混合后，置于37^℃水浴中1.5h。取出反应管放入冰水中5min。加入下列液体：

　　TRNA(25mg/ml)3μl

　　1×TE(pH8.0)180μl

　　酚100μl

　　CTAa 100μl

　　充分混合2min。离心15000r/min 5min。将上清液（约200μl）移入新的Eppendorf 管中，然后加入下列液体：

4mol/L醋酸胺100μl

100%酒精800μl

　　混匀，置冰浴中，15min。再15000r/min离心10min，在管底可见一白色沉淀块（含tRNA及寡核苷酸）。吸去管中液体，然后加入1000μl80%酒精，混合1～2min同上离心，吸除酒精（勿破坏沉淀块），将管置于40℃温箱中5min。加入适量的1×TE（pH8.0）及0.5mol/l DTT溶解沉淀。标记探针的最终浓度是0.5ng/μl,DTT的最终浓度为20mmol/μl。取出1μl标记探针测定比放射性，应在1.0×10dpm/μg以上。保存在-80℃中1～2个月。再次使用时应考虑到放射性同位素的衰减量。

　　三、应用特异单引物法标记DNA探针

　　应用探针DNA上的一个片段作为DNA引物，以环化探针DNA的重组质粒DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，通过变性，退火和延伸过程，使探针DNA得到标记。反应在0.5ml离心管内进行，总体积为25μl，内含50mmol/l Tris—HCl pH7.5, 10mmol/L MgCl₂、BSa 5mmol/L、80ng引物DNA和0.1μg连接的DNA或0.1μg质粒。反应管在95℃变性5min，取出，稍离心，立即放入37℃C水浴保温2min使DNA退火，加入1UE.coli DNA聚合酶I，在37℃进行延伸反应。对环化基因，延伸18min，对质粒DNA延伸35min重复上述变性、退火和延伸过程1次。

　　四、双引物法标记DNA探针法

　　反应在0.5ml管内进行，反应体积为50μl，内含50mmol/l Tris(pH7.5)、10mmol/l Mg－Cl₂、10mmol/L β-巯基乙醇和500μg BSA/ml，引物片段1和2各90ng，模板DNA0.1μg,[α-³²P]dCTp 1.5×10⁶Bq，dATp 、dGTP和dTTP各200μmol/L。标记反应包括3个步骤：

　　（1）变性：反应管在95℃水浴5min，然后离心；

　　（2）退火：37℃水浴2min；

　　（3）延伸：加入DNA聚合酶i 1u，37℃水浴18min。重复上述变性、退火、延伸过程1～2次，分别进行其标记率测定：取0.5μl反应液分别点于两张滤纸片上，烤干。一张经0.6mol/L三氯醋酸（TCA）、0.3mol/l TCA依次洗涤，每次10min，然后再用无水乙醇，醇醚混合液和乙醚洗涤各5min。两张滤纸分别放入闪烁瓶内，测定cpm值，达到10⁸cpm/μg DNA以上。

　　五、聚合酶链反应（PCR）标记高活性DNA探针

　　在0.5ml离心管内进行，反应总体积为50μl，内含模板DNA350ng,DNA引物各50pmol/L,dGTP、dCTP和dTTP各200μmol/L，[α-³²P]dATp 1.1×10⁶Bq，反应缓冲液为67mmol/l Tris—HCl pH8.8含2.5mmol/l MgCl₂、6.7mmol/L(NH₄)₂SO₄、10mmol/l β-巯基乙醇、170mg/l BSA、6.7μmol/l EDTA和40μl/ml二甲亚砜。将反应管置于95℃水浴变性5min取出，加入Taq DNA聚合酶0.5～2u,在旋涡混合器上混匀简单离心一下，加入35μl石蜡油。放入65℃水浴2min，取出，立即进入PCR循环：91℃变性30s,51^。C退火1min，68℃延伸2min。重复上述过程15次。最后将反应管置65℃水浴5min。反应完成，加入酵母tRNA10μg。分别测定参入和游离放射性计数，参入率为97.4%。标记DNA探针经醋酸钠酒精沉淀回收。将沉淀溶于10mmol/l Tris—HCl 、EDTA(pH8.0)100μl。用PCR方法标记的DNA探针特异性高，敏感性好，可测出的最低靶DNA量为10fg,利用PCR还可以作DNA探针的非放射性标记。