第二节　在病毒学中的应用

　　免疫细胞化学在病理学中的应用最为广泛，并取得了很大成果。

　　一、病毒抗原定位

　　免疫细胞化学技术十分适合于病毒和病毒抗原在组织培养和机体细胞内的生长繁殖定位的观察。

　　1．核内病毒定位犬肝炎，乙型肝炎核心抗原（HBcAg）,shope乳头状瘤，腺病毒IV型等病毒定位于细胞核内。

　　2．先核后浆定位水痘、流感（甲、乙）、鸡瘟、假狂犬病、单纯疱疹、腺病毒2，3，4，5，7型，多型瘤、劳斯探氏肉瘤病毒，先在核复制，随后在胞浆中定位。

　　3．先浆后核定位痘苗、脊髓灰质炎、麻疹等病毒是先在浆中复制，后进入细胞核。

　　4．核浆同时定位犬瘟热、麻疹和小鼠白血病病毒等。

　　5．胞浆内定位腮腺炎、新城疫、仙台病毒、流感、口蹄疫、鹦鹉热、狂犬病、小鼠脱足病、痘苗、墨内山谷脑炎、马脑炎、埃及101病毒、黄热、乙型脑炎、痘病毒、天花等病毒。

　　二、病毒感染过程

　　用免疫细胞化学方法可以看到病毒从宿主的细胞到细胞，丛一个部位到另一个部位的扩散过程，如用免疫荧光技术看到了犬肝炎病毒的血行扩散；犬瘟热病毒的淋巴和血行扩散。免疫荧光双重染色法用以观察双重病毒感染，如蜱传染毒（TBE）和麻疹病毒同时感染羊胚肾细胞，看到双重感染细胞中病毒抗原和核酸的分布不同于单种病毒感染者。

　　三、肿瘤与病毒

　　用免疫细胞化学可以观察肿瘤病毒和细胞，病毒抗原和肿瘤抗原之间的互相关系。如在不能查出传染病毒的肿瘤细胞中发现了病毒抗原；在典型的肉瘤细胞胞浆中发现了劳斯（Rous）氏肉瘤病毒；对EB病毒与非洲淋巴瘤、鼻咽癌和白血病等的关系进行了有价值的研究，并发现了与Eb 病毒感染有关的两类抗原，调查了某些疾病病人和正常人血清中抗EB病毒抗体的分布情况。王文亮等在原发性肝癌细胞中发现了乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）和核心抗体。

　　四、病毒计数

　　五、病毒的快速诊断

　　免疫细胞化学为病毒感染性疾病的快速诊断开创了一个广阔的道路（参见表16-2），最先用免疫荧光法作流感病毒快速诊断，证明有较高的特异性。随后，对流行性乙型脑炎，脊髓灰白质炎、呼吸道和肺炎腺病毒、疱疹病毒等进行了临床快速诊断，提高了诊治效果。近年，利用免疫细胞化学方法检测EB病毒IgA抗体诊断鼻咽癌取得突破性成果，对于早期诊治鼻咽癌作出了重大贡献。在早期诊断流行性出血热方面，免疫细胞化学方法更显示了其优越性，利用感染流行性出血热病毒的细胞培养标本，可以在发病的早期查出IgM抗体，作出早期快速诊断。检测患者血清中的抗体和效价，更有利于病毒感染性疾病的防治，也可直接检查病变中的病毒。

表16-2 免疫细胞化学在病毒学的应用

　　注：ACIF：抗补体免疫荧光法：DIF：直接免疫荧光；IIF：间接免疫荧光（引自：黄策：免疫荧光和荧光免疫，1983）

　　作者等用免疫荧光和ABC法在人肾组织中发现了流行性出血热病毒抗原。

　　免疫荧光细胞化学技术为病毒感染的快速诊断开辟了一条很有希望的道路，一方面可用于病原体检出，另一方面可用于抗体的检出。

　　（一）病毒的检查

　　1．原发感染材料的直接制片检查取病人或感染动物的末梢血液、尿、大便、脊髓液，咽喉鼻腔拭子、含嗽液、表皮病变渗出物、以及尸检材料等。进行直接法免疫荧光染色检查。可在2～3h以内得出初步结果。

　　2．组织培养物检查将取自病人或感染动物的材料感染培养细胞，待病毒在细胞内发育繁殖到一定程度后才能作免疫荧光检出，一般需10h以上。

　　3．接种动物感染材料检查将取自病人的感染材料接种实验动物如小鼠、鸡胚，使其发病，然后以免疫细胞化学方法检查实验动物的各种感染标本。

　　（二）抗体的检查

　　用已知病毒感染的细胞培养物为抗原，现酮固定10min，用病人待检血清与抗原反应20min，再用抗人IgG和IgM荧光抗体分别染色30min，按常规洗涤、裱封、镜检。一般需在发病过程中，前后两次检查（急性期和恢复期各一次），证明被检血清的染色强度有4倍以升高时，方能确定诊断。它比常规血清学方法操作简便，对有些病毒感染敏感性较高。张新生等利用金黄色葡萄球菌表面蛋白A（SPA）能与IgG的Fc段结合这一特点，用全菌体作为标记靶吸附病毒，形成花环状结构，再用2%磷钨酸负染色后在电镜下观察，操作简便，易于推广。

　　（三）常见病毒的快速检查方法

　　1．乙型肝炎病毒抗原的快速检查方法作者用免疫荧光间接法，PAP法和ABC法分别对人活体肝穿刺组织和尸检的肝炎、肝硬化和肝癌组织、先用10%甲醛固定、石蜡包埋切片，进行了乙型肝炎病毒HBsAg、HBcAg 和HbcAb的检查，在肝细胞、胆管上皮细胞和癌细胞内发现了这些抗原或抗体，对诊断和发病机理研究有重要意义。

　　2．狂犬病毒的快速检查方法可直接检查活检和尸检材料或查角膜印片中的狂犬病毒抗原，用直接法最成功。也可用间接法检测IgM抗体进行早期诊断。最好用免疫荧光法。

　　3．疱疹病毒的快速检查方法疱疹病毒（HSV）的抗原用直接免疫荧光检查，常取眼结合膜细胞，皮肤刮片，活检和尸检材料。

　　4．巨细胞病毒的快速检查方法用抗补体荧光抗体方法作此病毒抗原的特异性检查，常取尿沉渣中的细胞涂片标本进行检查。

　　5．流感病毒的快速检查方法最早用免疫荧光法检查流感病毒，一般采用直接法检查鼻咽部脱落细胞涂片中的病毒抗原。也可用间接法检测抗体，必须使用单价特异性羊抗人IgG荧光抗体，以避免与上皮细胞上的IgA发生非特异性荧光。

　　6．麻疹病毒的快速检查方法检查麻疹病人出疹前后的鼻咽部分泌物和眼结合膜中的细胞可快速检出病毒抗原。也可用尿沉渣细胞标本直接法检出抗原。用间接免疫荧光法可检出病毒抗体作快速诊断。

　　7．流行性出血热病毒快速检查方法直接法检查白细胞中的抗原，单克隆抗体可制备高效价的荧光抗体。用间接法可快速检出病人IgM抗体，对病人进行早期诊断是我国的创新，世界卫生组织向各国推荐。

　　8．爱滋病病毒抗体免疫荧光检查方法目前常用以下方法检查患者血清中的AIDS病毒抗体，对高危人群和可疑患者进行病毒抗体检查具有重要的意义。

　　抗原片：将AIDS病毒感染的Hu-T-78细胞用PBS制成悬液，滴于玻片上，吹干，丙酮固定，装入塑料袋中，密封，-40^℃保存。阴性对照用Hu-T-78细胞，同上法滴片处理。

　　间接免疫荧光检查法。

　　（1）先将待检血清用PBS作1：16稀释，取30μl滴加在抗原片上，放入湿盒，37^。C30min。

　　（2）用0.01mol/L,PBS Ph7.0洗涤2次，每次3min。

　　（3）滴抗人IgG荧光抗体，湿盒37℃3min。

　　（4）PBS洗2次，每次3min。

　　（5）缓冲甘油封片，荧光显微镜检查。

　　结果：抗原片细胞浆内出现弥散荧光，阴性对照无荧光。

　　9．其他病毒的快速检查方法腺病，带状疱疹病毒，付流感病毒，流行性腮腺炎病毒，呼吸道细胞病毒，风疹病毒，肠道病毒，乙脑病毒，森林脑炎病毒，登革热病毒等已有报告用免疫荧光法检查抗原或抗体作快速诊断。