第十八章 血清载脂蛋白的免疫测定
血浆中蛋白质种类繁多，对各种单一蛋白进行快速而又特异的定量。目前公认的方法是免疫测定法，即利用其特异的抗体，采用测定抗原抗体复合物的方式定量。血浆（清）中载脂蛋白是以脂蛋白形式存在的少量蛋白，在解联剂作用下，使载脂蛋白从脂蛋白中分离出来，再利用相应的载脂蛋白抗体进行测定。
载脂蛋白的免疫测定方法很多，目前采用的方法各有其特点，所需条件也有差异，现将医学检验中常用的定量方法作一简要介绍。
第一节 血清载脂蛋白定量的方法学及其参考值的评价
一、载脂蛋白测定方法
1．单向免疫扩散法（radial immunodiffusion,RID）
该法较简单，一般实验室均可进行。消耗较多的抗血清，扩散过程至少24h，最多需72h，测定下限值为10μg/ml。该方法虽然简单，应严格控制有关条件如：含抗血清的琼脂糖凝胶厚度要均匀；加入小孔的稀释抗原（血清）量要准确；含ApoB的脂蛋白如VLDL和LDL颗粒大小不一，如琼脂糖凝胶浓度在1.5%～2.0%,可能仅测出LDL的ApoB，大颗粒的LDL及VLDL的ApoB可能无法测出，因为难以穿过琼脂糖凝胶的孔隙。另外，扩散过程中，凝胶板一定要水平，否则易使扩散环呈椭圆形，难以准确测量直径。一般使沉淀环以3.5～10.0mm为宜，应在两个方向测量直径，其精度要求达到0.1mm。采用五种不同浓度参考值，测定沉淀环面积对相应浓度关系以曲线回归方程作图。
2．电免疫测定法（electroimmunoassay,EIA）
该法灵敏，抗血清用量少，如琼脂糖缓冲液中加入聚乙二醇及甘氨酸，其电泳时间可缩短一倍，火箭峰高以1～4cm为宜，火箭峰的测量可以计算面积或峰高，峰高从中心量起。测量精度最好能在0.1mm,灵敏度约2μg/ml，又称为火箭电泳法。
3．免疫比浊法(immunoturbidimetry assay,ITA）
简便快速，在自动分析仪进行操作并能批量检测，是目前临床使用最多的方法学。免疫比浊法有两种：一是测定光散射的，又名免疫散射比浊法（INA）；需用特殊的激光浊度仪；另一种是利用光度计测定通过混浊溶液后的透光强度，称为透射免疫比浊法（ITA），其灵敏度低于INA。比浊法可以终点法和速率法测定，速率法是根据散射光强度与时间的关系，以微机处理计算出抗原抗体复合物形成的最大反应速度，后者与溶液中抗原量成正比，常可在1min内完成测定过程，可自动扣除空白；终点法比速率法稳定，一般多用终点法。
4．酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）
该技术已广泛应用于极微量蛋白的定量测定，可测出ng级水平的抗原或抗体含量，该法可用于ApoE、C-Ⅱ、C-Ⅲ等含量较少的载脂蛋白的定量测定。
5．放射免疫法（radioimmunoassay,RIA）
该法灵敏，抗血清用量少，所需设备较多，一般用125I标记抗原作为示踪物，除ApoC-Ⅰ（不含酪氨酸）以外，都可以作碘标记（氯胺T法），以双抗体法测定RIA法可检测最低至3～5ng。临床检验中不常用此法，主要用于动物实验的科学研究工作。
还有荧光免疫法和化学发光法等灵敏度很高的方法。
血清载脂蛋白测定的方法，从测定原理、方法学评价及参考值，刘秉文和李健斋等人作了大量的工作，为国内的载脂蛋白测定的临床应用奠定了基础。周新曾于1986年首先在国内研制成功抗人ApoB100血清，其后，国内同仁陆续研制出ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、E、CⅡ、CⅢ抗血清，并广泛应用于临床的疾病诊断，在部分大医院已成为常规检查项目。
刘秉文在“脂蛋白与动脉粥样硬化“一书中全面总结了国内外载脂蛋白测定的方法学及其参考值，本节将引用如下比较表：
表18-1 ApoAⅠ免疫测定法的比较
| |
RIA |
ELISA |
EIA |
RID |
INA |
ITA |
| 抗体 |
P，M |
P，M |
P |
P，M |
P |
P |
| 灵敏度（n） |
0.3～10 |
0.1～0.5 |
100 |
100 |
150 |
100 |
| 测定范围（ng） |
1～200 |
0.5～15 |
100～500 |
200～800 |
200～500 |
200～600 |
| 批内CV（%） |
3～9 |
4～8 |
3～5 |
6 |
3～7 |
1 |
| 批间CV（%） |
5～10 |
8～10 |
3～9 |
10 |
6～7 |
6 |
| 正常值（g/L） |
1.0±0.2 |
1.5±0.2 |
1.2±0.2 |
1.2±0.1 |
1.2±0.2 |
1.7±0.2 |
P:多克隆抗体；M：单克隆抗体；RIA：放射免疫法；ELISA；酶联免疫法；RID：单向免疫扩散法；INA：免疫散射比浊法；ITA：免疫透射比浊法。
（源自：刘秉文，1995.）
表18-2 ApoAⅡ免疫测定法的比较
| |
RIA |
ELISA |
EIA |
RID |
INA |
ITA |
| 抗体 |
P |
P，M |
P |
P |
P |
P |
| 灵敏度（g） |
0.5 |
|
20 |
5 |
30 |
20 |
| 测定范围（ng） |
1～20 |
5～50 |
30～60 |
50～400 |
50～900 |
40～150 |
| 批内CV（%） |
7 |
8 |
5 |
5 |
5 |
5 |
| 批间CV（%） |
9 |
7 |
8 |
- |
7 |
6 |
| 正常值（g/L） |
0.25±0.4 |
0.35±0.05 |
0.76±0.2 |
0.29±0.02 |
0.37±0.09 |
0.36±0.03 |
（源自：刘秉文，1995.）
表18-3 ApoAⅣ免疫测定法的比较
| |
RIA |
ELISA |
EIA |
| 抗体 |
P |
P |
P |
| 灵敏度（g） |
5 |
0.2 |
20 |
| 测定范围（ng） |
5～50 |
0.5～8 |
50～200 |
| 批内CV（%） |
5 |
3.60 |
5 |
| 批间CV（%） |
7 |
8 |
9 |
| 正常值（g/L） |
0.17±0.03 |
0.14±0.05 |
0.14±0.04 |
（源自：刘秉文，1995.）
表18-4 ApoB100免疫测定法的比较
| |
RIA |
ELISA |
EIA |
RID |
INA |
ITA |
| 抗体 |
P，M |
P，M |
P |
P，M |
P |
P |
| 灵敏度（n） |
5～10 |
2～20 |
50～300 |
300 |
300 |
300 |
| 测定范围（ng） |
0～100 |
2～10 |
20～500 |
50～600 |
300～500 |
100～500 |
| 批内CV（%） |
4～8 |
4～7 |
1～7 |
3～7 |
4～7 |
2 |
| 批间CV（%） |
7～11 |
10 |
3～10 |
6～7 |
7～8 |
2 |
| 正常值（g/L） |
0.9±0.2 |
0.85±0.1 |
0.6±0.3 |
0.8±0.2 |
0.8±0.2 |
0.8±0.3 |
（源自：刘秉文，1995.）
表18-5 ApoCⅠ免疫测定法的比较
| |
RIA |
ELISA |
INA |
| 抗体 |
P |
P |
P |
| 灵敏度（n） |
1 |
5 |
50 |
| 测定范围（ng） |
5～30 |
15～100 |
- |
| 批内CV（%） |
7 |
3 |
5 |
| 批间CV（%） |
9 |
5 |
8 |
| 正常值（g/L） |
0.05±0.03 |
0.06±0.002 |
0.06±0.01 |
（源自：刘秉文，1995.）
表18-6 ApoCⅡ免疫测定法的比较
| |
RIA |
ELISA |
EIA |
RID |
ITA |
| 抗体 |
P |
P |
P |
P |
P |
| 灵敏度（g） |
10 |
0.3 |
45 |
40 |
10 |
| 测定范围（ng） |
10～80 |
0.5～5 |
70～600 |
40～600 |
12～50 |
| 批内CV（%） |
6 |
3 |
6.5 |
2.1 |
3.3 |
| 批间CV（%） |
10 |
8 |
8.2 |
3.9 |
6.2 |
| 正常值（g/L） |
0.04±0.01 |
0.033±0.008 |
0.04±0.002 |
0.039±0.017 |
0.04±0.01 |
（源自：刘秉文，1995.）
表18-7 ApoCⅢ免疫测定法的比较
| |
RIA |
ELISA |
EIA |
RID |
INA |
ITA |
| 抗体 |
P |
P |
P |
P |
P |
P |
| 灵敏度（g） |
1 |
0.3 |
10 |
76 |
20 |
15 |
| 测定范围（ng） |
2～20 |
1～6 |
20～80 |
76～600 |
50～400 |
30～120 |
| 批内CV（%） |
13 |
4.3 |
8 |
2.5 |
6.3 |
5.2 |
| 批间CV（%） |
13 |
4.3 |
8 |
3.5 |
6.3 |
5.2 |
| 正常值（g/L） |
0.15±0.06 |
0.16±0.03 |
0.12±0.04 |
0.127±0.037 |
0.12±0.03 |
0.11±0.03 |
（源自：刘秉文，1995.）
二、人血浆（清）载脂蛋白参考值比较
刘秉文于1995年对国人血浆（清）各项载脂蛋白参考值与国外参考值作了详细的比较，其报道见表18-9、18-10、18-11、18-12、18-13、18-14、18-15。
表18-8 ApoE免疫测定法的比较
| |
RIA |
ELISA |
EIA |
RID |
ITA |
| 抗体 |
P |
P，M |
P |
P |
P |
| 灵敏度（n） |
0.2～8 |
0.5 |
20 |
35 |
5 |
| 测定范围（ng） |
0.8～100 |
0.5～6 |
20～200 |
50～300 |
20～400 |
| 批内CV（%） |
6 |
4 |
8 |
5.9 |
2 |
| 批间CV（%） |
9 |
8 |
5 |
7.2 |
5 |
| 正常值（g/L） |
0.05±0.02 |
0.04±0.01 |
0.10±0.04 |
0.035±0.01 |
0.04±0.01 |
（源自：刘秉文，1995.）
表18-9 国人血浆ApoAⅠ含量与国外报道的比较
| 作者 |
发表时间 |
方法 |
例数 |
性别 |
年龄 |
均值±s（mg/dl） |
| 张祖辉 |
1998 |
RID |
307 |
男 |
20-77 |
122.1±13.7 |
| 刘秉文 |
|
|
318 |
女 |
20-77 |
125.5±15.9 |
| 李键斋等 |
1986 |
EIA |
291 |
男+女 |
19-50 |
119±17 |
| 周新等* |
1990 |
EIA |
692 |
男 |
13-85 |
129.1±16.1 |
|
477 |
女 |
18-80 |
130.5±14.2 |
| Albers等 |
1976 |
RID |
20 |
男+女 |
11.5±7.3 |
115.7±7.3 |
| Cheung等
|
1977 |
RID |
172 |
男 |
20-65 |
120±20 |
| 188 |
女 |
20-65 |
135±25 |
| Reman等
|
1978 |
RID |
95 |
男 |
40-49 |
137±23 |
| 104 |
女 |
40-49 |
137±23 |
| Schonfelcl等
|
1974 |
RIA |
41 |
男 |
13-58 |
100±35 |
| 34 |
女 |
16-58 |
104±34 |
| Karlin等
|
1976 |
|
23 |
男 |
20-39 |
130±3 |
| 19 |
女 |
20-39 |
154±6 |
| Avogaro等
|
1978 |
EIA |
60 |
男 |
20-60 |
128±22 |
| 60 |
女 |
20-60 |
134±20 |
| Mordasini等
|
1980
|
EIA |
50 |
男 |
20-60 |
113±9 |
| 50 |
女 |
20-60 |
125±17 |
| Miller等
|
1980 |
EIA |
8 |
男 |
34-70 |
122±27 |
| 8 |
女 |
52-68 |
149±20 |
| Rosseneu等
|
1981 |
IAN |
12 |
男 |
29 |
139±15 |
| 14 |
女 |
30 |
147±24 |
| Assmann等
|
1982 |
INA |
3032 |
男 |
20-65 |
136±23 |
| 1367 |
女 |
20-60 |
146±25 |
（源自：刘秉文，1995）
*：作者补充。
表18-10 国人血浆ApoAⅡ含量与国外报道的比较
| 作者 |
发表时间 |
方法 |
例数 |
性别 |
均值±s（mg/dl） |
| 罗静聪 |
1988 |
RID |
76 |
男+女 |
26.7±4.6 |
| 刘秉文 |
1988 |
ELISA |
41 |
男+女 |
24.2±5.9 |
| 胡维诚 |
1987 |
RID |
160 |
男+女 |
27.0±4.4 |
| Curry等 |
1976 |
RID |
19 |
男 |
78.0±1.7 |
| |
|
|
19 |
女 |
83.0±25 |
| Cheung等 |
1977 |
RID |
172 |
男 |
33.0±5 |
| |
|
|
188 |
女 |
36.0±6 |
| Assmann等 |
1977 |
EIA |
15 |
男 |
34.1±5 |
| |
|
|
15 |
女 |
38.3±5.5 |
| Schonfeld等 |
1977 |
RLA |
29 |
男+女 |
40.5±8.9 |
| Maupovic等 |
1981 |
ELA |
50 |
男+女 |
68.0±18 |
| Goldberg等 |
1980 |
RIA |
50 |
男 |
25.0±1 |
| |
|
|
50 |
女 |
26.0±1 |
| De Backnev等 |
1982 |
INA |
70 |
男+女 |
43.0±6.9 |
| Zech等 |
1983 |
RID |
27 |
男+女 |
24.0±0.6 |
| Noma等 |
1983 |
RLA |
27 |
男+女 |
32.0±8.3 |
| Nukita等 |
1984 |
EIA |
156 |
男+女 |
40.0±9 |
（源自：刘秉文，1995）
表18-11 国人血浆ApoB含量与国外报道的比较
| 作 者 |
发表时间 |
方法 |
例数 |
性别 |
均值±s（mg/dl） |
| 周新等 |
1986 |
EIA |
608 |
男 |
83.2±13.9 |
| |
|
|
511 |
女 |
80.4±13.4 |
| 李健斋等 |
1986 |
EIA |
727 |
男+女 |
76±19 |
| 吴兆丰、刘秉文 |
1987 |
RID |
304 |
男 |
87.9±14.4 |
| |
|
|
320 |
女 |
86.7±14.4 |
| Albers等 |
1975 |
RIA |
349 |
男+女 |
81.0±20 |
| Bantorich等 |
1975 |
RIA |
82 |
男+女 |
90.0±24 |
| Bedford等 |
1976 |
RIA |
128 |
男+女 |
87.0±30 |
| Schonfeld等 |
1974 |
RIA |
42 |
男+女 |
83.0±16 |
| Brussaard等 |
1980 |
EIA |
60 |
男+女 |
63±16 |
| Fruchart等 |
1981 |
EIA |
144 |
男+女 |
90 |
| Curry等 |
1978 |
EIA |
38 |
男 |
90±2.0 |
| |
|
|
36 |
女 |
88±11 |
| Curry等 |
1978 |
RID |
20 |
男+女 |
87±26 |
| Lees等 |
1970 |
RID |
64 |
男+女 |
83±25 |
| Snuderman等 |
1975 |
RID |
31 |
男 |
82±22 |
| Fievet等 |
1979 |
INA |
206 |
男 |
129±31 |
| |
|
|
271 |
女 |
120±34 |
| Heuck等 |
1979 |
INA |
68 |
男+女 |
82.0±23 |
| Rossenue等 |
1981 |
INA |
70 |
男 |
92±13 |
| Durrington等 |
1976 |
INA |
29 |
男+女 |
85±11 |
（源自：刘秉文，1995）
表18-12 国人血浆ApoCⅠ含量与国外报道的比较
| 作 者 |
发表时间 |
方法 |
例数 |
性别 |
均值±s（mg/dl） |
| 傅明德等 |
1987 |
ELISA |
202 |
男 |
7.6±2.5 |
| |
|
|
214 |
女 |
8.0±2.3 |
| Polz等 |
1980 |
RID |
10 |
男+女 |
6.9±2.0 |
| Curry等 |
1981 |
ELA |
68 |
男+女 |
6.0±1.5 |
（源自：刘秉文，1995）
表18-13 国人血浆ApoCⅡ含量与国外报道的比较
| 作 者 |
发表时间 |
方法 |
例数 |
性别 |
均值±s（mg/dl） |
| 傅明德等 |
1987 |
ELISA |
202 |
男 |
5.2±1.9 |
| |
|
|
241 |
女 |
4.9±1.8 |
| 范萍等 |
1989 |
RID |
67 |
男+女 |
3.9±1.7 |
| Schonfeld等 |
1979 |
RIA |
93 |
男+女 |
3.9±1.4 |
| Curry等 |
1981 |
EIA |
68 |
男+女 |
4.0±2.0 |
| Kashyap等 |
1977 |
RIA |
32 |
男+女 |
5.0±0.4 |
（源自：刘秉文，1995）
表18-14 国人血清ApoCⅢ含量与国外报道的比较
| 作者 |
发表时间 |
方法 |
例数 |
性别 |
均值±s（mg/dl） |
| 傅明德等 |
1988 |
ELISA |
134 |
男 |
11.6±3.6 |
| |
|
|
135 |
女 |
12.0±3.7 |
| 范萍等 |
1989 |
RID |
67 |
男+女 |
12.7±3.7 |
| 刘秉文等 |
1987 |
IRA |
21 |
男+女 |
9.2±2.1 |
| Schonfeld等 |
1979 |
RID |
93 |
男+女 |
15.4±6.2 |
| Curry等 |
1980 |
ELA |
54 |
男+女 |
10.9±3.0 |
| Kashyap等 |
1981 |
RIA |
29 |
男+女 |
11.1±0.9 |
（源自：刘秉文，1995）
表18-15 国人血浆ApoE含量与国外报道的比较
| 作 者 |
发表时间 |
方法 |
例数 |
性别 |
均值±s（mg/dl） |
| 刘铭锋、刘秉文等 |
1987 |
ELISA |
42 |
男+女 |
3.57±1.24 |
| 刘铭锋、刘秉文等 |
1987 |
ELA |
50 |
男+女 |
4.70±1.18 |
| 刘铭锋、刘秉文等 |
1992 |
RID |
116 |
男 |
3.95±0.98 |
| |
|
|
122 |
女 |
4.00±1.32 |
| 张东升、夏辉明 |
1991 |
ELISA |
25 |
男+女 |
3.45±1.24 |
| Blum等 |
1980 |
RIA |
26 |
男+女 |
3.6±1.3 |
| Gregg等 |
1984 |
RIA |
12 |
男+女 |
4.8±1.2 |
| Wesgraber等 |
1984 |
RIA |
|
男+女 |
5(3.5-7.0) |
（源自：刘秉文，1995）
王抒、李健斋等于1996年报道283例血清各项载脂蛋白测定值及百分位数，如表18-16、18-17、18-18所示。这批数据是目前国内采用同一份标本检测脂质、脂蛋白和载脂蛋白项目最多的1次报道。除了作为参考值供临床应用外，并阐明了各项指标之间的相关性。笔者予以抄录，供参考。
表18-16 血脂与脂蛋白水平（mmol/L）
| 项目 |
男（225例） |
女（58例） |
P值 |
| TC |
4.87±0.73 |
5.16±0.84 |
＜0.05 |
| TG |
1.27±0.66 |
1.25±0.71 |
＞0.05 |
| HDL-C |
1.41±0.35 |
1.54±0.36 |
＜0.02 |
| HDL2-C |
0.56±0.17 |
0.63±0.19 |
＜0.02 |
| HDL3-C |
0.86±0.23 |
0.91±0.19 |
＞0.05 |
| LDL-C |
2.95±0.68 |
3.13±0.12 |
＞0.05 |
（源自:王抒，1996）
表18-17 几项常用比值*
| 项 目 |
男 |
女 |
| LDL-C/HDL-C |
2.21±0.72 |
2.16±0.80 |
| HDL2-C/HDL3-C |
0.66±0.12 |
0.69±0.15 |
| ApoB/ApoAⅠ |
0.72±0.16 |
0.74±0.17 |
| ApoAⅠ/ApoAⅡ |
4.10±0.65 |
4.10±0．68 |
| ApocⅡ/ ApoCⅢ |
0.39±0.12 |
0.41±0.16 |
男女组间无显著意义
（源自：王抒，1996）
表18-18 各项载脂蛋白测定值与百分位数
| 项目 |
X±S |
p5 |
p25 |
p50 |
p75 |
p95 |
| 男（225例） |
|
|
|
|
|
|
| ApoAⅠ(g/L) |
1.42±0.17 |
1.17 |
1.30 |
1.43 |
1.51 |
1.72 |
| ApoAⅡ(g/L) |
0.36±0.66 |
0.28 |
0.32 |
0.35 |
0.40 |
0.46 |
| ApoB(g/L) |
1.01±0.21 |
0.72 |
0.86 |
1.00 |
1.14 |
1.38 |
| ApoCⅠ(mg/L) |
53±17 |
31 |
43 |
50 |
60 |
83 |
| ApoCⅡ(mg/L) |
34±16 |
13 |
24 |
31 |
42 |
69 |
| ApoCⅢ(mg/L) |
44±17 |
26 |
34 |
41 |
51 |
74 |
| ApoE(mg/L) |
44±17 |
26 |
34 |
41 |
51 |
74 |
| Lp(α)(mg/L) |
144125 |
26 |
53 |
107 |
185 |
382 |
| 女（58例） |
|
|
|
|
|
|
| ApoAⅠ(g/L) |
1.45±0.14 |
1.21 |
1.34 |
1.44 |
1.55 |
1.74 |
| ApoAⅡ(g/L) |
0.36±0.06 |
0.26 |
0.33 |
0.36 |
0.39 |
0.44 |
| ApoB(g/L) |
1.07±0.23 |
0.71 |
0.90 |
1.08 |
1.20 |
1.49 |
| ApoC(mg/L) |
53±18 |
30 |
39 |
51 |
61 |
92 |
| ApoCⅡ(mg/L) |
41±18 |
20 |
28 |
38 |
49 |
77 |
| ApoCⅢ(mg/L) |
104±40 |
52 |
72 |
100 |
129 |
184 |
| ApoE(mg/L) |
51±18 |
33 |
37 |
48 |
58 |
89 |
| Lp(α)(mg/L) |
154±116 |
35 |
66 |
117 |
207 |
464 |
国内的已有报道表明，人血清载脂蛋白参考值水平尚有一定的差异。引起这种差异的原因是多方面的，目前认为主要原因有：①检测方法与仪器不同；②试剂质量尤其是抗血清技术标准不统一；③国内尚未采用完全符合国际标准的定值血清；④人群的生活习惯及种族差异。为此对于国人的血清载脂蛋白参考值的确立，尚需付出艰辛的劳动。