第四节 非酯化脂肪酸测定
临床上将C10以上的脂肪酸称为游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）或非酯化脂肪酸（nonesterified fatty acid,NFFA），正常血清中含有油酸（18:1,W9）占54%，软脂酸（16：0）占34%，硬脂酸（18：0）占6%，是其主要的NFFA。另外还有月桂酸（12：0）、肉豆蔻酸（14：0）和花生四烯酸（20：4，W6，9，12，15）等含量很少的脂肪酸。与其他脂质比较，NFFA在血中浓度很低，其含量水平极易受脂代谢，糖代谢和内分泌机能等因素影响，血中NFFA半寿期为1～2min，极短。血清中的NFFA是与清蛋白结合进行运输，属于一种极简单的脂蛋白。
测定血清NFFA法有滴定法。比色法，原子分光光度法，高压液相层析法和酶法等。一般多以酶法测定。作NFFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在，极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。贮存标本仅限于24h内，若保存三天，其值约升高30%，使结果不准确。
1．非酶法测定
非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。前三种方法准确性差；高压液相层析法，仪器太昂贵，不便于批量操作。
2．酶测定法
主要用脂肪酶测定。血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A（CoA）进行定量。酶法测定结果准确可靠，快速，易于批量检测。测定原理如图15-6所示。
图15-6 血清主要FFA酶法测定图
□：内物质作为生成量与变化量进行测定；ACS：乙酰CoA合成酶；MK：肌激酶； PK：丙酮酸激酶；POD：丙酮酸氧化酶；DTNB：α-磺基苯甲酸；ACO：乙酰CoA氧化酶；ACD：乙酰CoA脱氢酶。
一、光度法
1．原理
血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中，形成铜皂在上层溶剂中，再用二苯卡巴肼与铜显色，进行定量。
2．试剂组成
| 代号 |
种类 |
浓度 |
组成 |
贮存2～8℃ |
有效期 |
| R-1 |
抽提剂 |
|
氯仿：庚烷：甲醇=5：5：1（V/V） |
|
|
| R-2 |
缓冲液 |
33mmol/L |
KH2PO44.539g/L 100ml+Na2HPO4·2H2O5.983g/l 50ml调pH至6.4 |
|
|
| R-3 |
铜贮液 |
500mmol/L |
Cu（NO3）2·3H2o 12.07g加H2O→100ml |
|
|
| R-4 |
三乙醇胺 |
1.0mol/L |
三乙醇胺10ml，加水→100ml |
|
|
| R-5 |
NaOH液 |
1mol/L |
|
|
|
| R-6 |
铜试剂 |
|
R-3 10ml+R-4 10ml+R-6 6ml +H2O→100ml调pH至8.1 |
|
|
| R-7 |
二苯卡
巴肼液 |
|
二苯卡巴肼（乙醇）液（4g/L）10ml+R-4 0.1ml |
|
临用前配制 |
| R-8 |
软脂酸标准贮存液 |
2mmol/L |
软脂酸51.2mg溶于100ml R-1液 |
冷藏 |
|
| R-9 |
R-8的应用液 |
500μmol/L |
用R-1液稀释 |
冷藏 |
|
3．操作
按图15-7操作。
4．计算
血清游离脂肪酸（μmol/L）=ESA/EST×500
二、酶法
1．原理
血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸（NEFA），经酶试剂作用生成紫色化合物，其颜色深浅与NEFA含量成正比。
2．试剂组成
| 代号 |
种类 |
组成 |
浓度贮存 |
贮存 |
| R1 |
缓冲液 |
磷酸缓冲液
MgCl2液
去垢剂 |
0.04mmol/LpH6.9
3mol/L |
|
| R2 |
酶/辅酶 |
乙酰CoA合成酶
抗坏血酸氧化酶
CoAATP 4-AAP 溶于10ml R1液中 |
≥0.3U/ml ≥1.5U/ml 0.9mmol/L 5.0mmol/L 1.5mmol/L |
冷藏5日 |
| R3 |
酶稀释液 |
苯氧乙醇 去垢剂 |
0.3%(V/V) |
|
| R4 |
|
马来酰亚胺 该试剂与R3等体积混合 |
10.6mmol/L |
|
| R5 |
酶试剂 |
乙酰CoA氧化酶 过氧化物酶 TOOS 混合上述试剂，再等体积R4试剂混合 |
≥10U/ml 7.5U/ml 0.2mmol/L |
冷藏5日 |
| R6 |
标准液 |
|
1mmol/L |
冷藏 |
*应用带玻塞离心管
3．操作
按图15-8操作。
4．计算
图15-7 血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图
图15-8 血清非脂化脂肪酸测定（酶法）操作图
（胡汉宁 储建中）
参考文献
1．李健斋.提高血脂、脂蛋白检测水平的意见.中华医学检验杂志，1994，17：5～6
2．康克非主编.临床生物化学实验室数据与病例分析.重庆：重庆大学出版社，1997
3．周新主编.医学检验项目与临床意义.武汉：湖北科学技术出版社，1996
4．王霞文主编.临床生化检验技术。南京：南京大学出版社,1995，205～216
5．李健斋.血浆（清）胆固醇测定方法的现状，中华医学检验杂志，1982，5：56
6．李培英等.应用国产酶试剂测定血清胆固醇.临床检验杂志，1985，3：3
7．Siedel j ,et al .Reagent for the enzymatic determinationof total cholesterol with improved lipolytec efficiency.Clin Chem,1983,29:1075
8．陈惠黎主编，生物化学检验技术，北京：人民大学出版社，1990
10．朱忠勇主编，实用医学检验学，北京：人民军医出版社，1992
11．王勤富等，酶法测定甘油三酯液体型标准参考物质的研制，中华医学检验杂志，1990，13：377-379
12．王抒，李培瑛，陈文祥等，血清胆固醇标准参考物质的研制，中华医学检验杂志，1996，19：216-219
13．中华医学会检验学会血脂测定推荐方法，二。血清总胆固醇酶法测定（草案）。中华医学检验杂志，1995，18：185
14．陈文祥，董军，李培瑛等，胆固醇纯度标准物质的研制，中华医学检验杂志，1994，17：211
15．Ellerbe P,Myers GL,Coopre GR,et al.A comparison of res
ults for choesterol in hyuman serum obtainde by reference method and the definitive method of the national reference systerm for cholesterol.Clin Chem,1990,36:370
16．王辉，李培瑛，王抒等。中华医学会检验学会血脂测定推荐方法，一。血清总胆固醇测定参考方案（草案）。中华医学检验杂志，1995，18：114-116
17．Manninen V.Tenkanen L,Koskinen P,et al .Joint effects of serun triglyceride and LDL-cholesterol concentrations on coronary heart risk in the Helsinki Heart study.Circulation ,1995,85:37-45