第十四章　抑扬基因表达对脂蛋白代谢及动脉粥样硬化的影响

　　能够直接影响血浆脂质代谢的蛋白质至少有十八种，它们可划分如下三大类：

　　1．载脂蛋白类：包括ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、C、E和（a）等；

　　2．血浆脂酶类：包括脂蛋白脂肪酸（LPL）、肝脂酶（HL）、卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）和胆固醇酯转移蛋白（CETP）等；

　　3．受体类（receptors）：包括有低密度脂蛋白受体（LDL-R）、乳糜微粒残粒受体、清道夫受体、以及低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）等。

　　近十年来，编码这些“脂质相关蛋白质”的各个基因已相继由不同的实验室分离和克隆，所有这些基因在人类基因组中均为单拷贝。流行病学调查和临床观察发现人类异常脂蛋白血症和动脉粥样硬化的发病与这些基因中的某个基因或几个基因联合突变有着密切联系。为了探索异常脂蛋白血症和动脉粥样硬化发病的分子机制，二项新的分子生物学技术被应用于这一研究领域：一个是转基因技术（transgenic technique），将上述各个基因分子别或联合一起整合到动物的基因组内，导致这种动物高效率高产量地表达某一个或几个基因，从而建立一系列“转基因动物”模型，主要是转基因小鼠（rtanstgenic mice）。这种“转基因”技术主要是通过“微注射”（microinjection）或反转病毒（retrovirus）感染的方式将人或某种动物的编码某一“脂质相关蛋白质”的基因移植到小鼠胚胎干细胞（embryonal stem cells）内，从而达到增强表达（overexpression）的目的。另一项分子生物学技术称为基因剔除（knockout）技术，运用同源重组原理，将动物内源性某一个或几个编码“脂质相关蛋白质”的基因分别剔除或摧毁，导致这种基因的表达低于正常状态或甚至完全不能表达，因而建立“基因缺陷或缺乏动物”模型。运用这一套抑扬基因表达的策略，观察所引起的脂蛋白代谢变化和对动脉粥样硬化发生、发展及转归的影响，人们对异常脂蛋白血症和动脉粥样硬化发病机制的认识得到了相当程度的扩展、更新和修正。

　　冠心病的发病呈现显著性的家族遗传倾向，认识各个基因对脂蛋白代谢调控的分子机制，能够为动脉粥样硬化的基因治疗奠定理论基础；建立相应的基因检测手段，早期、及时地检测和监控这些与脂蛋白代谢有密切关连的基因表达状态，对于异常脂蛋白血症和冠心病的预测、预防、诊断、治疗和预后等工作，极具参考和指导意义。

第一节　载脂蛋白基因表达的抑扬

　　一、ApoAⅠ

　　ApoAⅠ是HDL的主要蛋白，占HDL总蛋白的70%。1989年由美国Breslow实验室首先将编码人类ApoAⅠ的基因分别整合到小鼠及大鼠的基因组内。ApoAⅠ在小鼠和大鼠体内的增强表达选择性地升高了血浆HDL胆固醇（HDL-C）水平。这项观察与人群研究结果一致，表明血浆ApoAⅠ浓度与HDL-C水平正相关，同时也提示可以采用升高血浆ApoAⅠ水平的措施来达到升高血浆HDL含量，从而改善血浆脂蛋白图谱特征（lipoprotein propile）的目的。

　　人类ApoAⅠ基因在小鼠体内的增强表达同时也改变了小鼠HDL的物理特性。野生型小鼠（Wildtype）的HDL颗粒通常显示均一性大小的特点。当表达了人类ApoAⅠ基因后，小鼠HDL颗粒分成大小二类，分别对应于人类血浆中的HDL₂和HDL₃颗粒尺寸。这说明ApoAⅠ本身能控制HDL的颗粒大小和分布，同时也解释了人类HDL颗粒大小的多态型。这种高效表达有人类ApoAⅠ基因的动物还被用来研究饮食和药物对HDL-C和ApoAⅠ水平的影响。实验结果显示许多食物和药物成分在大幅度改变血浆HDL-C和ApoAⅠ浓度时，不影响ApoAⅠmRNA水平。因而提示如下两点：（1）血浆ApoAⅠ的调控环节主要存在于转录后水平（posttranscriptional level），而不是转录水平；（2）在很大的生理甚至病理范围内，ApoAⅠ或HDL受体被饱和的可能性很小。在动脉粥样硬化的发病研究方面，ApoAⅠ基因的增强表达能减少动脉内泡沫细胞的形成和堆积。HDL能预防和对抗动脉粥样硬化发病的理论学说由此得到支持。

　　与ApoAⅠ基因的增强表达相对应，剔除（knockout）内源性ApoAⅠ基因的小鼠也研制成功。正如所料，这种小鼠由于没有表达ApoAⅠ基因，血浆HDLCh浓度极低。用普通饲料喂养这种缺乏ApoAⅠ基因的小鼠后，血浆总胆固醇和HDL-C均下降约75%左右。HDL所含胆固醇酯的流动性下降八倍，但组织内所含的游离和酯化的胆固醇含量正常，唯有肾上腺组织的胆固醇酯含量下降。有趣的是，组织学检查表明这种缺乏ApoAⅠ的小鼠，即使用高脂饲料喂养20周后，也不出现动脉粥样硬化的病理学变化，因而提示：虽然高浓度血浆ApoAⅠ和HDL能预防和对抗动脉粥样硬化的形成，低浓度血浆ApoAⅠ和低浓度HDL-C本身却不足以诱发动脉粥样硬化。

　　二、ApoAⅡ

　　ApoAⅡ在HDL中的含量仅次于ApoAⅠ，约占HDL总蛋白的20%。将人类ApoAⅡ基因在小鼠体内增强表达后，这种ApoAⅡ转基因小鼠的血浆HDL-C水平不受影响。这又与临床观察相一致，即血浆ApoAⅡ浓度与HDL-C含量无显著相关性。然而，这种小鼠的一部分HDL颗粒变小，且仅含有ApoAⅡ，不含ApoAⅠ；另一部分大小正常的HDL颗粒则含ApoAⅠ和AⅡ两者。这提示人类ApoAⅡ可能只影响HDL的颗粒大小而不影响HDL的血浆浓度。在动脉粥样硬化的发病方面，如果同时增强表达ApoAⅠ和AⅡ基因，ApoAⅠ本身的“保护防御“作用反被削弱，提示富含有ApoAⅡ的HDL颗粒不具有抗动脉粥样硬化的能力，也说明HDL的“防御动脉粥样硬化”功能只与ApoAⅠ有关。

　　三、ApoAⅣ

　　ApoAⅣ既可结合到HDL也能游离于血浆，主要由小肠合成，其功能尚不明确，推测可能与LCAT的激活、胆固醇逆向转运，以及小肠吸收脂质有关。将人类ApoAⅣ基因在小鼠体内增强表达后，血浆脂蛋白特征并无明显变化，餐后VLDL有升高趋势，小肠吸收甘油三酯、胆固醇、维生素A和E均正常，因而看不出ApoAⅣ有任何特定的生理功能。或许生理状态下的ApoAⅣ水平已足以发挥其作用。

　　四、ApoB

　　ApoB是乳糜微粒、VLDL、IDL和LDL的运载蛋白，人类肝脏合成的Apob 是一个完整的长度，分子量约520000道尔顿，称为ApoB₁₀₀，而小肠所合成的ApoB由于细胞内mNRA的“编辑加工”处理，其分泌出的ApoB分子仅为肝脏所分泌ApoB分子长度的48%，故称为ApoB₄₈。将人类ApoB基因整合到小鼠基因组内增强表达后，血浆ApoB水平上升，总胆固醇含量升高，这主要是由于LDL-C水平升高所致，LDL颗粒内所含甘油三酯的比例增大。尽管野生型小鼠血浆LDL水平远比人类血浆低，ApoB转基因小鼠的血浆LDL上升到相当于人类血浆LDL的浓度。

　　应用基因重组技术Homanics等首先于1993年剔除了小鼠内源性ApoB基因。这种Apob 缺乏的小鼠不仅表现出VLDL、IDL和LDL-C的下降，而且连HDL-C也降低。纯合子型Apob 缺乏的小鼠在胚胎发育期即死亡，杂合子型的死亡率也显著升高，神经管发育不全。能幸存的杂合子型ApoB缺乏小鼠出现雄性生殖机能下降。虽然HDL-C和血浆ApoAⅠ浓度低，肝组织内ApoAⅠmRNA水平并无异常变化，说明低水平ApoB状态能在翻译后水平影响和调节ApoAⅠ的生物合成。

　　五、ApoC

　　ApoC包括三个亚类：CⅠ、CⅡ和CⅢ，其中ApoCⅢ转基因小鼠最先被研制成功。ApoCⅢ主要结合于VLDL和HDL颗粒，其基因表达速率与血浆甘油三酯水平成正比。将人类ApoCⅢ基因在小鼠体内增强表达后，其血浆VLDL颗粒增大，富含甘油三酯，成为典型的人类原发性高甘油三酯血症动物膜型。这种动物血浆ApoCⅢ含量升高，ApoE含量相对下降，游离脂肪酸浓度也升高。动力学研究显示。ApoCⅢ转基因动物所发生的高甘油三酯血症主要是由于其VLDL清除障碍引起，而与ApoB的合成速度无关。从这类小鼠血浆分离出的VLDL对LDL对受体的亲和力下降。但对脂蛋白脂肪酶（LPL）的分解无影响。这项研究证明ApoCⅢ基因的增强表达能直接引起高甘油三酯血症，说明了ApoCⅢ在调节人类血浆甘油三酯水平过程中的重要作用。由于约有三分之一的中年人都表现有不同程度的高甘油三酯血症，而因其他基因异常所引起高甘油三酯血症的机率极小，因此，临床观察和控制ApoCⅢ水平应受到重视。

　　ApoCⅠ的功能目前尚不明确，已知ApoCⅡ是血浆LPL的生理激活因子。增强表达人类ApoCⅠ的转基因小鼠出现轻度高甘油三酯血症。出乎意料之外的是，增强表达人类ApoCⅡ基因后，小鼠也出现了高甘油三酯血症，其表现如同ApoCⅢ转基因小鼠。这种ApoCⅡ转基因小鼠表现有VLDL堆积，VLDL颗粒内ApoCⅡ比例增大，ApoE比例下降，VLDL清除障碍，而其合成无异常。由此看来，ApoCⅡ的功能远比人们所知道的要复杂。更令人费解的是，剔除ApoCⅡ基因而引起ApoCⅡ缺乏的动物也同样表现有高甘油三酯血症。

　　六、ApoE

　　ApoE是HDL和VLDL的蛋白成分之一。也是LDL受体和乳糜微粒残粒受体的结合蛋白。因而在血浆脂蛋白的清除过程中发挥重要作用。1992年由于Shimano等首先研制ApoE转基因小鼠，高效表达大鼠来源ApoE基因，导致血浆ApoE浓度高于正常倍4倍以上，其血浆VLDL和LDL-C含量显著下降。同位素示踪研究显示放射性VLDL和LDL颗粒的清除速度明显加快。不仅如此，这种高ApoE浓度的动物能对抗由高脂饲料诱导的高胆固醇血症。这说明高浓度ApoE能减少空腹状态下的致动脉粥样硬化性质的脂蛋白成分，并防止高脂饮食诱发异常脂蛋白血症。

　　ApoE基因剔除的小鼠模型也于1992年由Piedrahita等研制成功。与ApoB基因剔除后的表现不同，即使是纯合子型的ApoE基因缺乏，动物也能存活，生殖功能正常。当给这种ApoE缺乏的动物喂以普通饲料后。其血浆胆固醇水平可高达10.34-12.93mmol/L，这种胆固醇主要堆积于VLDL和IDL颗粒内。如果用西方型高脂饲料喂养这种ApoE缺乏小鼠，其血浆胆固醇可高达46.5mmol/L，也主要分布于VLDL和IDL部分。这些小鼠的甘油三酯无明显异常，提示存在有富含胆固醇的脂蛋白颗粒，类似于β-VLDL。动力学研究表明这种ApoE缺乏动物存在严重的脂蛋白清除障碍，完全证实了ApoE的受体结合功能。杂合子型的ApoE缺乏小鼠表现轻度降低的血浆ApoE水平，而其他脂蛋白水平正常，餐后脂血症时间轻度延长。由此可见，即使表达50%的ApoE基因也足以维持正常的脂蛋白代谢状态。

　　ApoE基因剔除的小鼠是动脉粥样硬化研究的良好模型。这种缺乏ApoE的纯合子型小鼠即使用普通饲料喂养，动脉壁亦出现明显的泡沫细胞沉着堆积。当用西方型高脂饲料喂养四周后，动脉粥样硬化斑块增大3倍以上，其病理特征、组织学分布等十分类似于人类动脉粥样硬化病变。其泡沫细胞内的脂质斑块富含有氧化型脂蛋白颗粒，血浆抗自身氧化型脂蛋白的自身抗体含量也明显升高。小鼠本是很不容易诱发动脉粥样硬化的动物种群，ApoE单个基因的变化能导致严重的高胆固醇血症和动脉粥样硬化，这显示ApoE在人类冠心病发病过程中扮演重要角色。

　　七、Apo（a）

　　Apo（a）是一种糖蛋白，以二硫键结合于LDL颗粒的ApoB分子上，野生型小鼠不表达Apo（a）基因，血浆也检测不出Apo（a）蛋白。将人类Apo（a）基因转送到小鼠体内增强表达后，小鼠血浆Apo（a）含量可高达9mg/dl，但不结合到小鼠的LDL颗粒上，而是以游离形式存在。此时如果注射人类LDL到小鼠血液系统，则上述所表达的Apo（a）与人源性LDL结合到一起。这说明人类Apo（a）只特异性与人类ApoB分子结合，也许是由于小鼠ApoB分子缺乏所对应的半胱氨酸残基的原因，尽管流行病学研究资料显示含Apo（a）脂蛋白（LP-（a））与冠心病有着不可分割的关系，增强表达了人类Apo（a）的小鼠并不出现动脉粥样硬化病变。由于人源性Apo（a）不结合到小鼠自身的LDL颗粒上，这项结果可提示Apo（a）本身并无致动脉粥样硬化的特性，或许这种特性是在Apo（a）结合到LDL后才获得并表现出来。