第三节　分子生物学实验诊断技术

　　一、核酸杂交技术

　　检验方法建立的基本要素是特异性和灵敏度，在复杂的物体中，使无法感觉的特定物质进入人类的观察范围。核酸杂交检测技术就是利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。该法建立以来已有二十年，目前研究实验室用得多，临床实验室用得较少，除成本高外，关键是操作复杂，重复性差，仅能半定量。成本高可随经济发展而缓和，但其它缺点尚需努力克服。

　　杂交实验的探针应具有特异性，对应不同的杂交方法靶基因（被检基因）应有一定的纯度与丰度。杂交反应的开始是碰撞，探针浓度高则速率增加，一般³²P标记探记探针5-100ng/ml，非放射性探针25-1000ng/ml，原位杂交无论放射还是非放射物标记，一般都需0.1-5.0μg/ml。当探针过量时，杂交速率取决于探针长度，如一个100ng/ml20个核苷酸的合成寡核苷酸探针与1-100pg 1kb长的靶基因杂交，10分钟能达到最大杂交率。而相同条件下2kb的克隆探针需160小时。主要原因是这里所指浓度是重量浓度而非摩尔浓度。长探针因标记量大，小的摩尔浓度已足以达到需要的检测灵敏度。为了促进长探针（＞250个核苷酸）的杂交速率，加入杂交促进剂是非常必要的。最常用的是硫酸葡聚糖，使用浓度为5％-10％，浓度过高会增加杂交液粘度。聚乙二醇也作为促进剂，价廉且粘度低，但检测本底太高。另外杂交的温度、盐浓度、甲酰胺浓度可调节杂交分子形成的稳定性。理论选用DNA：DNA杂交温度T＝Tm－25℃，此时杂交分子最易形成。但具体实验中影响Tm值的因素很多，一般杂交温度低，形成的杂交分子较稳定。RNA：DNA杂交分子的Tm大10-15℃，RNA：RNA杂交分子的Tm大20-25℃，使得杂交温度提高，此时需调节甲酰胺浓度来调节杂交温度。好的实验条件最终应在实践中摸索建立。

　　（一）斑点杂交

　　将少量核酸样品点样在硝酸纤维素滤膜上，80℃烘烤后可牢固地固定在膜上，再用探针进行杂交。尼龙膜，特别是聚偏氟乙烯膜（PVDF）与DNA结合力更高，坚韧、易操作。点样可手工，也可用真空点样品。检测可用放射性探针自显影或非放射性探针显色。可用于DNA或RNA分析。下面以非放射性探针分析DNA为例，结果是显色。

　　取硝酸纤维素膜和滤纸在2xSSC(NaCl 300mmol/L，柠檬酸钠30mmol/L)，pH7.0浸15分钟，平铺滤纸在点样抽滤器上，再铺上硝酸纤维滤膜，真空抽气使点样器减压，膜显出凹面。点样50μl（5-10μgDNA，可直接点血清样品）于凹面，撤去真空，把膜晾干。取滤纸浸0.5mol/l NaOH，1.0mol/l NaCl，把膜平铺于滤纸上20分钟，变性。取滤纸二张分别浸在0.5mol/l Tris-Hcl pH7.5和1.0mol/l Tris-HCl，0.6mol/l NaCl pH7.5，分别依次把膜平铺于滤纸上，各中和15分钟，中和后膜的pH为7.2-7.5。于80℃，30-45分钟烘干。（RNA分析点样缓冲液系统不同，无需变性，中和，余大致相同）用塑料封口机把膜和2.5ml预杂交缓冲液封入塑料袋中，42℃，水浴30分钟。

　　50xDenhardt：5g聚蔗糖（Ficoll，400型，Parmacia），5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（组份Ⅴ，Sigma）加水至500ml。过滤后－20℃保存。

　　探针2ml（50-100ng/2ml预杂交缓冲液）于100℃，10分钟，马上置冰浴5分钟（变性）。加入袋封口。42℃水浴过夜。去杂交液（可回收）。以2xSSC，0.1％SDS15ml，50℃5分钟洗二次。0.1SSC，0.1％SDS洗二次。封闭：另取袋封入膜和封闭液（蛋白质50mg/ml，100mmol/l Tris-HCl(pH7.5)/150mmol/L NaCl）2.5ml，37℃，30分钟。去封闭液（可回收）。100mmol/l Tris-HCl(pH7.5)/150mmol/L NaCl ，15ml，5分钟洗二次。亲和反应：酶标抗体3ml（酶有碱性磷酸酶、过氧化物酶等，标记物有抗地高辛、生物素等，现以地高辛标碱性磷酸酶为例4μg/3ml 100mmol/L Tris-HCl，150mmol/l MgCl₂，10mg/ml牛血清白蛋白），封入袋中37℃，30分钟。100mmol/l Tris-Hcl，100mmol/l NaCl，50mmol/l MgCl₂，pH9.5，10ml，1分钟洗一次。取硝基四氮唑兰（NBT）75mg/ml 70％二甲基甲酰胺25μl，4-溴-5-氯-3-吲哚磷酸50mg/ml二甲基甲酰胺20μl（底物）和100mmol/l Tris-HCl，100mmol/l NaCl，50mmol/l MgCl₂，pH9.56ml混匀，37℃，避光反应三小时，显色。蒸馏水洗膜，晾干。观察结果。

　　（二）Southern blot

　　1975年E.Southern发明了将DNA切开，电泳分离，再变性，印迹到硝酸纤维（Nc）滤膜上，用探针进行杂交，检测DNA的方法。自显影或显色用于DNA分析。以³²P标记放射性探针为例，放射自显影观察结果。（图18-6）。

图18-6　Southern blot体系

　　前述分离、纯化的DNA样品5-10μg/100μl TE，加限制性内切酶3Unit/1μgDNA和内切酶相应缓冲液，在相应温度保温1-3小时（不同的酶所用的缓冲液和温度不同），乙醇沉淀，15-20μl TE溶解DNA断片。前述电泳条件，与DNA分子量标准品（Marker，Ladder）一起，3-4V/cm电泳（30V12-15小时）。在紫外光下观察Marker充分分离，结束电泳。将胶放入0.5mol/l NaCl，0.5mol/L NaOH液体中30分钟，使DNA变性。同时将膜用蒸馏水浸润，在0.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH液体的方盘皿上，放上滤纸两头浸在液体中，依次放上凝胶、膜、滤纸、一尺厚的吸水纸，压力1kg的重物。转移（印迹，blot）过夜。翌日，把膜放在0.5mol/l Tris-HCl，pH7.0-7.5，1mol/L NaCl液中，中和膜上碱性变性液15-30分钟。戴上手套，用手指压在膜上来回充分洗膜。室温干燥一小时。用塑料封口机，把膜和预杂交缓冲液封在塑料口袋中，注意驱除袋内汽泡。热水浴过夜。探针变性后，加入袋中再封口。热水浴过夜。

　　（三）Northern blot

　　用于RNA分析，电泳条件与转膜方法与Southern blot不同外，RNA不必变性与中和，电泳时加电醛防止RNA发夹结构形成。其它步骤相同。

　　为了防止RNase水解需分析的mRNA，尽可能将器皿在160-180℃干热灭菌8小时以上，也可加0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）泡2小时，灭菌水淋洗干净，100℃干烤15分钟。不能干热灭菌的试剂等，也可加1％DEPC处理12小时（但不能用于Tris）后，100℃。加热15分钟（或高压灭菌15分钟）以抑制、分解RNase。1.0g琼脂糖，灭菌水80ml加热溶解。加x50TAE2ml，EB25μl，灭菌水至1000ml。样品缓冲液，x50TAE20μl，50％去离子甲酰胺500μl，甲醛180μl，混匀。约10-30μg/10μl纯化的RNA样品，加二倍（20μl）样品缓冲液（可点样一个凝胶孔lane）。60℃水浴15min，马上置冰浴。加1/10电泳指示剂。点样电泳，75-80V电泳4-5小时（指示剂泳动7～8cm），结束电泳。电泳期间正负极缓冲液要不断交换（可用蠕动泵），以免pH改变。电泳结束，将凝胶放在紫外光下可观察到人rRNA大亚基28S（5.1kb），小亚基18S(2.0kb)，记下大小亚基移动距离（或拍照），可作为被测mRNA分子量分析的参照物。凝胶在50mmol/l NaOH中变性30分钟（低浓度碱，此步可省）。膜在10xSSPE中浸20分钟。用10xSSPE转移过夜（同Southern blot）。80℃1-2小时干燥。用探针杂交后，显影或显色。

　　（四）原位杂交（insitu hybridization）

　　在保持细胞形状条件下，进行细胞内杂交，显影或显色。用于DNA或RNA分析。

　　细胞用离心涂片机涂片或组织切片置于载玻片上。4％多聚甲醛（PFA）/PBS固定（固定时间因标本而异10-20分钟，也可用含2％甲醛，0.05％戊二醛，2.5mmol/l CaCl₂的0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.3，500W微波炉中照射10-20秒，固定）。马上用PBS洗标本三次，2.5μg/ml蛋白酶K，37℃，5-20分钟（因标本和固定条件而定）处理。磷酸盐类缓冲液（PBs NaCl 137mmol/l，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄8.1mmol/L，KH₂PO₄1.5mmol/L）洗涤。4％PFA/PBS后固定，PBS洗一次，0.2％甘氨酸/PBS洗二次，每次15分钟。预杂交：42℃，1小时。预杂交缓冲液：10％硫酸葡聚糖，10％Denhardt液，0.5％吐温－20，250μg/ml鲑鱼精子DNA，500μg/ml酵母tRNA。杂交：42℃，4小时。用2x杂交缓冲液（4xSSC，0.2mol/L磷酸钠pH6.5，2xDenhardt）溶解已标记探针，使其终浓度为0.1-1.0μg/ml。DNA检测时把探针覆盖在标本上，置100℃5分钟（变性）取出，杂交。mRNA检测则先把探针置95℃水浴3分钟，立即置冰水浴，再覆盖标本上进行杂交。覆盖标本用液量100-200μl洗涤：2xSSC，50℃过夜。0.2xSSC，室温1小时。载玻片浸在缓冲液中。显色（试剂、方法参照斑点杂交的封闭-显色部分）20分钟-2小时，显微镜下观察结果。

　　二、核酸扩增技术

　　通过大肠埃希菌繁殖而增殖重组质粒，也是扩增核酸的手段。但在试管中有效扩增DNA的方法，是在90年代才开展起来的多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）新技术。由于PCR灵敏度高、特异性好、操作方便，在我国发展很快。目前，PCR技术结合分子生物学实验技术（如逆转录反应杂交技术等）开发了许多PCR新技术（reverse transcriptase PCR；PCR-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP；巢式PCR(二次PCR)；热启动PCR等）。RT-PCR用于RNA分析；PCR-SSCP分辨率高，可用于点突变分析；二次PCR特异性好，灵敏度高；热启动PCR可提高特异性。

　　PCR技术原理是在了解DNA一级结构基础上设计引物（primer或sense，人工合成），DNA多聚酶可识别并结合引物，以单链DNA为模板，dNTP为底物，合成其互补链。通过反复变性，反复合成互补链的过程，达到DNA扩增的目的。人的DNA扩增引物长度多为20个核甘酸。（图18-7）

图18-7　PCR技术原理

　　PCR反应：DNA样品0.1-1μg，引物1，2各25-100pmol，dNTP各200μmol/L，Tris-HCl（pH8.3）10mmol/L，KCl 50mmol/L，MgCl₂ 1.5mmol/L，gelatin（明胶）0.01％，Taq多聚酶2.5-5U，矿物油一滴。93℃7分钟→50-55℃2分钟→70-72℃3-1.5分钟→93℃2分钟。

　　将反应物和Marker点样于凝胶一起电泳，紫外光下观察结果，拍照保存结果。反应物也可用于印迹（杂交）实验、多态分析、探针制备等。

　　注意事项：①DNA样品纯度高，Taq酶（和Klenow酶）有逆转录酶活性，DNA和RNA不能混在一起。②设计的引物分子内（特别3′端）和引物，1，2分子间不形成双链。选择性好，不增幅目的DNA以外区域的DNA。引物的G＋C含量为40％-60％。③dNTP浓度过高易使Taq酶合成错误，一般在200μmol/L，有人建议40-50μmol/L。④KCl＞75mmol/L对酶有抑制作用。Mg²⁺浓度过高，NDA不易变性，＞10mmol/L可抑制酶活性40％-50％。⑤多聚酶：Taq多聚酶从嗜热菌分离得到（1989年，在此以前1985年利用Klenow酶因不耐热每经过一次热变性要补加一次酶），现在经基因克隆的重组体产物Taq酶最适pH8.3～8.8（室温8.3-8.4），反应温度75-80℃，95℃以上失活明显。无3′→5′校读活性，对SDS敏感（＜0.01％活性也受到抑制，加吐温－20可抵制SDS抑制）。该酶有逆转录酶活性。⑥退火温度一般设定为Tm－5℃，但实际上与引物一级结构序列有关，设计不当可造成非特异性退火，而造成非特异扩增，此时应调整温度和相应的时间。⑦循环次数受到的影响因素较多，增加次数可提高灵敏度，但易出现非特异扩增。⑧PCR灵敏高，被检样品极易被污染，样品纯化，扩增，检测区域应分开。房间应经常用紫外光照射。扩增物应定点丢弃，处理。

　　三、核酸限制性片段长度多态性（RFLP）分析

　　RFLP分析是限制性内切酶、核酸电泳、印迹（blot）技术、探针-杂交技术的综合应用，多用于临床遗传性疾病的基因诊断。基本原理是遗传性疾病多有基因的缺陷，如基因缺失、基因插入、编码区小范围核苷酸序列改变或点突变等。前二者可将纯化的正常人和病人DNA同时用限制性内切酶切成片段，经电泳分离、印迹、探针杂交等找到目的基因。由于患者基因的缺失或插入，造成被限制性内切酶切开的片段（分子量）大小与正常人发生差异（限制性片段长度多态），使其电泳迁移率发生差异，而达到基因诊断的目的。小区域或点突变，可选用一个限制性内切酶的切点正好在这一变异位置，使切割作用和正常人发生差异（如正常人基因可切断而患者不能，或反之），达到诊断目的。现在PCR产物经变性为DNA单链，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，只要有一个核苷酸发生变异，其电泳迁移率就会改变，进行多态分析（PCR-SSCP）。实际上把基因的异常位置设计在PCR扩增区域内，就能进行多态分析。（图18-8）

　　核酸纯化→内切酶作用→电泳分离→Southern blot→探针-杂交→显影，显色

图18-8　点突变Eco R1 RFL

　　四、核酸一级结构（核苷酸序列sequence）分析

　　核酸一级结构分析是基因分析最直接的第一手资料。目前DNA、RNA以及蛋白质的一级结构分析中，DNA的碱基序列分析方法多样、简单、快速。下面就M13噬菌体-双脱氧核苷酸（ddNTP）的DNA测序法介绍如下。

　　M13是单链DNA噬菌体，转染宿主菌体复制为双链增殖，又以单链形式透出菌体。把待测DNA重组插入双链M13复制型DNA中，经培养扩增，可分离得到单链M13DNA（含待测单链DNA的碱基序列），即复制模板。在待测DNA的3′端人工合成引物，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，复制链延长。在ddNTP（2′,3′双脱氧核糖核苷三磷酸）存在下，复制延长随机受阻，形成分子量（长度）大小不等的片段。电泳分离，自显影，读图18-9分析碱基序列。

图18-9　核酸碱基序列分析

　　0.2-0.3mm厚度聚丙烯酰胺-尿素凝胶，高压（1600V）电泳，可分辨一个核苷酸的差异。电泳后干燥凝胶，自显影，自下往上读图，得到5′→3′的合成链碱基序列，其互补链是待测DNA的3′→5′碱基序列。